基因组dna的提取课件PPT.ppt

1 分离纯化基因组DNA 【目的】 了解基因组DNA提取的原理与基本方法。 掌握硅胶膜吸附法提取DNA的方法 。 2 核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象。核酸样品的质量直接关系到实验的成败。 【原理】 3 DNA提取原则1：DNA片段长度（完整性） DNA提取原则2：排除其它分子污染（纯度） 4 破碎细胞 提 取 纯 化 5 破碎细胞 提 取 纯 化 机 械 法 化 学 法 酶 法 8 9 【试剂与器材】 1.小白鼠（3人一组，每2组一只） 2.微量加样器 3.匀浆器 4.动物组织基因组DNA 提取试剂盒 5.生理盐水 10 小白鼠 肝 脱颈处死 脱颈处死 右手抓住鼠尾用力向后拉,同时左手拇指与食指用力向下按住鼠头。将脊髓与脑髓拉断，鼠便立即死亡。 【操作流程】 11 匀浆器匀浆 采用相应的蛋白变性剂和蛋白酶K进行处理，消化蛋白 【操作流程】 沉淀核酸 消化去蛋白 12 【操作流程I】 肝+ 2 mL 生理盐水 700µL匀浆液 离心12000 rpm, 1 min,弃尽上清 破碎细胞 加 GA 200 µL 振荡至彻底悬浮 加 蛋白酶K 20 µL 56℃, 60 min,裂解组织，消化蛋白 短暂离心（5秒） 加 GB 200 µL 充分混匀，70℃, 10 min 短暂离心（5秒） 标记！！ 上交，-20℃保存 硅胶膜吸附法 消化蛋白 13 14 【操作流程II】 加 乙醇 200 µL 混匀至少15s 短暂离心 硅胶膜吸附法 裂解的样本 加入吸附柱 缓冲液冲洗 DNA洗脱收集 注意：动作要轻柔 15 【操作流程II】 硅胶膜吸附法 裂解的样本 加入吸附柱 缓冲液冲洗 DNA洗脱收集 将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中； 吸附柱放入收集管中 ； 12,000rpm离心30s； 倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中 注意：未完全消化的组织块不要加入吸附柱中！！！ 16 【操作流程II】 硅胶膜吸附法 裂解的样本 加入吸附柱 缓冲液冲洗 DNA洗脱收集 漂洗液漂洗去蛋白片段，盐分和其它杂质 向吸附柱中加入500μL GD，12,000rpm离心30s，弃废液，将吸附柱放回收集管中； 向吸附柱中加入700 μ LPW，12,000rpm离心30s，弃废液，将吸附柱放回收集管中； 向吸附柱中加入500 μ LPW，12,000rpm离心30s，弃废液，将吸附柱放回收集管中； 17 【操作流程II】 硅胶膜吸附法 裂解的样本 加入吸附柱 缓冲液冲洗 DNA洗脱收集 洗脱前要充分空甩，以除去乙醇的影响； 采用合适的缓冲液 注意: 将吸附柱放回收集管中，12,000rpm，离心2min，倒掉废液: 将吸附柱开盖放置5min，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液; 将吸附柱转入干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100uL洗脱缓冲液TE，室温放置5min； 12,0OOrpm离心2min，将DNA溶液收集到离心管中 洗脱缓冲液体积不应少于50μL，体积过小影响回收效率； 为增加基因组DNA的得率，可将离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室温放置2min，12,000rpm离心2min； 洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响，应在7.0-8.5范围内； DNA产物应保存在－20℃。 18 【操作流程Ⅱ】 (总结) 溶液和絮状沉淀转入 加 PW 700 µL 加 GD 500 µL 12,000rpm,离心30s ，弃废液 加 PW 500 µL 充分混匀 短暂离心 勿加入组织块！！ 检测样品浓度和纯度，余下样品，-20℃保存 加 乙醇 200 µL 12,000rpm,离心30s ，弃废液 12,000rpm,离心30s ，弃废液 12,000rpm,离心30s ，弃废液 12,000rpm,离心2min，去乙醇 晾干5min 加 TE 100 µL 加在膜中心！！ 吸附柱套入新离心管，室温放置5min 12,000rpm,离心2min，收集滤液 可重复洗脱 动作轻柔 19 纯度（OD260/OD280） 紫外分光光度计进行测量（选择正确的稀释倍数）OD260/OD280 1.7 说明有蛋白的污染OD260/OD280 ＝1.8 (1.7～1.9) 说明纯度很好OD260/OD280 1.9 说明有部分降解或有RNA污染 得率 紫外分光光度计进行测量Yield＝ OD260×50ng/μL×稀释倍数（双链DNA） DNA检测方法－紫外分