利用MTT法测定不同抗肿瘤药物对Hela细胞增殖的抑制效果.docVIP

利用MTT法测定不同抗肿瘤药物对Hela细胞增殖的抑制效果 摘要:对肿瘤细胞生物学特性的研究,使大量抗肿瘤化疗药物应用于临床,使肿瘤患者的治愈率及生存率获得了明显的提高。环磷酰胺是治疗恶性肿瘤最常用的烷化剂代表药物,具有广谱抗癌作用,是联合化疗、手术和放疗辅助化疗的常用药物之一, 因此选用环磷酰胺对Hela细胞处理计算其抑制率.本实验结果表示:浓度为:50ug/ml,100ug/ml, 200ug/ml,400ug/ml的环磷酰胺对Hela细胞增殖的抑制率呈现明显的加强. 关键词:Hela细胞 MTT法测定 环磷酰胺 环磷酰胺可使血清中假胆碱酯酶减少，使血清尿酸水平增高，因此，与抗痛风药如别嘌呤醇、秋水仙碱、丙磺舒等同用时，应调整抗痛风药物的剂量。此外也加强了琥珀胆碱的神经肌肉阻滞作用，可使呼吸暂停延长。环磷酰胺可抑制胆碱酯酶活性，因而延长可卡因的作用并增加毒性。 1 实验材料与试剂 1.1 实验材料: Hela 细胞系 1.2试剂:环磷酰胺溶液 (50ug/ml 100ug/ml 200ug/ml 400ug/ml) MTT 溶液的配制方法 2 实验方法 2.1、普通MTT法实验步骤(标准曲线测定) 2.1.1. 稀释细胞：用0.25%胰蛋白酶消化贴壁生长的细胞，用含5%～10％胎牛血清的培养液 将细胞吹打为单细胞悬液，调整细胞浓度约为5?105个/ml；取100 μl加入900 μl的培养液内，得到浓度约为5?104个/ml作为原初浓度的细胞。对原初浓度的细胞进行1：1倍比稀释，分别得到1：2、1：4和1：8的稀释细胞 （细胞浓度约为2.5?104个/ml、1.25?104个/ml和0.625?104个/ml）。 2.1.2. 接种细胞：取上述的各浓度的细胞各200 μl，接种到96孔板内；一般同一浓度的细胞接种4孔作为重复实验。同时，将未知浓度的细胞200 μl作为待测样品同样加到96孔板的4个孔内。 2.1.3. 培养细胞：同一般培养条件，培养3～5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。 2.1.4. 呈色：培养3～5天后，每孔加5 mg/ml的MTT溶液20 μl，继续孵育4 h，终止培养；快速翻转培养板，弃去孔内培养上清液；然后每孔加DMSO 150μl，振荡30min，使结晶物充分融解。 2.1.5. 比色：选择490nm或570nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。 2.1.6. 分析与计算：通过Excel软件以吸光值为横坐标，接种细胞浓度为纵坐标绘制曲线；生成接种细胞浓度与吸光值间的趋势曲线及其指数方程，根据该方程计算出未知浓度的原始接种浓度。 2.2 药物MTT法实验步骤 2.2.1. 接种：收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，使细胞浓度为2～3?104/ml，每孔加入细胞悬液200μl，使每孔内的细胞数为4000- 6000个。 2.2.2. 培养与药物处理：培养箱内培养24～36h，吸出培养液加入不同浓度梯度的各种抗肿瘤药物各200 μl，原则上，每个浓度至少接种4孔作为重复实验，否则难以反应真实情况。 2.2.3. 呈色：培养箱内继续培养到第3天，于倒置显微镜下观察细胞生长情况后，每孔加5 mg/ml的MTT溶液20 μl，继续孵育4 h，终止培养；快速翻转培养板，弃去孔内培养上清液；然后每孔加DMSO 150μl，振荡30min，使结晶物充分融解。 2.2.4. 比色：选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。 2.2.5. 计算与分析：按照公式计算各种药物处理对细胞增殖率的影响。 细胞增殖抑制率＝（未加药物处理的对照组吸光值－药物处理组的吸光值）/未加药物处理的对照组吸光值。 3 实验结果 由实验数据表示:光吸收值与环磷酰胺的浓度呈负相关,证明随着环磷酰胺浓度从50ug/ml到200ug/ml的升高,对Hela细胞增殖的抑制率升高.实验数据下表表示: 表1 实验不同浓度环磷酰胺处理的光吸收值 环磷酰胺 对照组 50ug/ml 100ug/ml 200ug/ml 400ug/ml 光吸收值 0.869 0.549 0.481 0.430 0.331 抑制率 0 36.82% 44.65% 50.52% 61.91% 图1 不同浓度环磷酰胺处理的光吸收值对比 4 实验分析 4.1 环磷酰胺是治疗恶性肿瘤最常用的烷化剂代表药物,具有广谱抗癌作用,是联合化疗、手术和放疗辅助化疗的常用药物之一, 环磷酰胺的毒副作用主要是免疫抑制[ 1 ]。临床适应症:环磷酰胺为目前广泛应用的烷化剂,对淋巴瘤、白血病、多发性骨髓瘤均有效,对乳腺癌、丸肿瘤、卵巢癌、肺癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、横纹肌瘤及骨肉瘤也均有一定疗效[ 2