DNA克隆转化与筛选基因与蛋白质工程课件.pptVIP

§5 DNA克隆转化与筛选技术 克隆基本过程 如果要克隆较小的DNA片段（10kb），质粒要比其他任何载体都好，在质粒载体上进行克隆，其基本过程是： 先用限制性内切酶切割质粒DNA和目的DNA片段 然后在体外使两者相连接， 再用所得到的重组质粒转化细菌，即可完成。 目的DNA片段的获得 基因 基因克隆核酸途径 基因克隆蛋白质途径 ? ? ? ? ? ? 一、 DNA片段和质粒载体的连接 1、连接反应策略： A. 带有非互补突出端的片段 B. 带有相同的粘性末端的片段 C. 带有平末端的片段 PCR产物与载体连接 ① 载体平末端加dT或ddT：TaqDNA聚合酶会在3’端加上多余的非模块依赖碱基，而且对A优先聚合，所以PCR产物末端的多余碱基大部分都是A。利用这一特点，载体平末端用酶加上dT或ddT，使载体在PCR产物末端互补并进行连接。载体末端加dT尾可直接用TaqDNA聚合酶和dTTP或ddTTP。 目前一些公司已开发出可直接用于克隆PCR产物的带3’-T-Vector。 附：载体加dT尾方法 实验步骤： 将1ul pUC19用Sma I全酶切。 在小管中按上述PCR反应，加入各种混合物，其中4ul 4种dNTP改为4ul 25 mmol/L dTTP. 加入1ul（5单位）的Taq DNA聚合酶在72℃下加热2小时。 用酚：氯仿：异戊醇抽提两次。 加入两倍体积无水乙醇，在-20℃下沉淀1小时。 离心，用70%乙醇漂洗后，真空抽干，溶于10 ul ddH2O中。 Klenow片段 2、连接反应操作步骤 取新的经灭菌处理的0.5ml eppendorf管，编号. 将0.1ug载体DNA转移到无菌离心管中，加相应摩尔量（可稍多）的外源DNA片段。 加蒸馏水至体积为8ul，于45℃保温5分钟，以使重新退火的粘端解链。将混合物冷却至0℃. 加入10 X T4DNA连接酶缓冲液1ul、T4DNA连接酶0.5ul，混匀后用微量离心机将液体全部甩到管底，于16℃保温8-24小时，同时做两组对照反应，其中对照组一只有质粒载体无外源DNA；对照组二只有外源DNA片段没有质粒载体。 二、 大肠杆菌感受态细胞制备和转化 转化（transformation）是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段。 （一）、感受态细胞制备 1、感受态细胞概念 在自然界条件下，很多质粒都可通过细菌结合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体上，一般缺乏转移所必须的mob基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细胞，需诱导受体细胞产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA. 受体细胞经一些特殊方法（如CaCl2、RbCl（KCl）等化学试剂）处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性改变，成为能允许外源DNA分子进入的细胞状态，这些细胞称为感受态细胞（competent cells）。 2、感受态细胞制备方法 目前常用的感受态细胞制备的方法中，RbCl（KCl）方法制备的感受态细胞转化效率高，但CaCl2方法简便易行，且其转化效率完全可满足一般实验的要求，因此CaCl2方法使用更广泛。 用于制备感受态细胞的菌株不要用经过多次转接或储存于4℃的培养基，最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种直接转接用于感受态细胞制备。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，(如DH5?的OD600为0.5左右，细胞密度为5?107)。 3、CaCl2法感受态细胞的制备步骤 （1）、试剂 LB液体培养基及不含Amp的LB平板 含Amp的LB平板：熔化的LB固体培养基在 600C左右时加Amp至50-100?g/ml. 混匀后铺板。 50mmol/L CaCl2溶液: 5.55g 无水CaCl2的定容于1000ml蒸馏水，灭菌