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建议实验一、死活细胞的鉴定一、实验原理死活细胞的鉴定在生物学和医学上具有很重要的意义。细胞培养过程中要随时记录细胞的生长情况，需要经常测定细胞的存活率；在肿瘤细胞的研究中，为了检验各种药物对肿瘤细胞的杀伤力，也需要测定肿瘤细胞的存活率。在临床医学中死活细胞的鉴定也有很大的应用，例如为了检测某一男子的生育能力，测定精子细胞的存活力是比较常用的办法。精子存活率以“活”精子比率表示，若不活动的精子较多，应体外活体染色检查，以鉴别其死活。活精子的细胞膜能阻止伊红Y、台盼蓝等染色剂进入细胞内，故不被染色；死精子细胞膜完整性受损。失去屏障功能，可被染色成橘红或蓝色，有生育力男性伊红染色法的活精子率≥75%。死活细胞的鉴定方法有很多种，常用的有染色法和仪器分析法。染色法是常用的细胞死活鉴定方法，简便，易于操作。但是通过直接的形态观察来鉴别细胞死活，实验结果很容易受操作者的主观因素的影响，存在一定的误差，所以，在实际操作中也常采用一些仪器来进行精确的批量检测。不同的死活细胞鉴定方法有各自不同具体的反应机理，但无论采用何种办法，都是利用了死活细胞在生理机能和性质上的差异。常用的方法包括染色法和仪器分析法。死活细胞在生理机能和性质上的差异主要包括：死活细胞细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择透性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性的通过；而细胞死亡之后，细胞膜受损，通透性增加。常用的以台盼蓝鉴别细胞死活的方法就是利用了这一性质。台盼蓝，又称锥蓝，是一种阴离子型染料，不能透过完整的细胞膜。所以经台盼蓝染色后只能使死细胞着色，而活细胞不被着色。甲基蓝有类似的染色机理。死活细胞在代谢上的差异：是采用美蓝染料鉴定酵母细胞死活的依据。美蓝是一种无毒染料，氧化型为蓝色，还原型为无色。由于活细胞中新陈代谢的作用，使细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝从蓝色的氧化性变为无色的还原型，因此美蓝染色后活的酵母细胞无色；而死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们的无还原能力或还原能力极弱，使美蓝处于氧化态，从而被染成蓝色或淡蓝色。中性红是一种低毒性染料，为常用的活体染料之一，可以使活细胞液泡着红色，而细胞质和细胞核不被着色；死细胞的液泡不被着色或浅染，染料弥散于整个细胞中，细胞核和细胞质被染成红色。中性红是一种弱碱性 pH 指示剂，变色范围 pH6.4～8.0 之间（由红变黄）。在中性或微碱性环境中，植物的活细胞能大量吸收中性红并向液泡中排泌，由于液泡在一般情况下呈酸性反应，因此，进入液泡的中性红便解离出大量阳离子而呈现樱桃红色，在这种情况下，原生质和细胞壁一般不着色；死细胞由于原生质变性凝固，细胞液不能维持在液泡内，因此，用中性红染色后，不产生液泡着色现象，相反，中性红的阳离子，却与带有一定负电荷的原生质及细胞核结合，而使原生质与细胞核染色。二、实验目的掌握死活细胞鉴定的原理和常用方法。三、实验材料与仪器1、实验材料：洋葱表皮，酵母，口腔上皮细胞2、实验仪器：载玻片、盖玻片、普通光学显微镜四、试剂配制方法1.0.4%台盼蓝染液：称取4g台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100ml，用滤纸过滤，4度保存，此为4%台盼蓝母液。使用时，取1ml母液，用9ml PBS稀释至0.4%，即可。2.1/3000中性红染液：取0.1g中性红于10ml Ringer溶液中，稍加热（30-40摄氏度）使溶解，用滤纸过滤，装入棕色试剂瓶，暗处保存，否则易被氧化，失去染色能力，此为母液。1/3000中性红溶液（用时现配），取母液1ml，加入29ml Ringer溶液，即成。3.0.1%吕氏碱性美蓝染液：0.3g美蓝溶于30ml 95%酒精中制成30ml美蓝酒精饱和液。取0.1g氢氧化钾定容于1L容量瓶中制成0.1g/L氢氧化钾溶液。用时将30ml美蓝酒精饱和液与100ml 0.1g/L的氢氧化钾溶液混合摇匀即可。4. PBS溶液:在800ml蒸馏水中溶解8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HPO4和0.24gKH2PO4，用HCl调节溶液的pH值至7.4加水定容至1L，在15lbf/in2（1034*105Pa）高压下蒸汽灭菌20min。保存于室温。5. Ringer溶液:在100mL蒸馏水中分别溶解NaCl 0.85g，KCl 0.25g和CaCl2 0.03g。五、实验前准备主要仪器：普通光学显微镜（25台/班，1台/组）辅助仪器：镊子25把/班，1把/组；载玻片250个/班，10个/组；盖玻片300个/班，12个/组耗材：擦镜纸、吸水纸（各25包/班，各1包/组）药品试剂：0.4%台盼蓝、0.1%中性红、1%中性红、1%甲基蓝、1%中性红-甲基蓝、浓蔗糖溶液均为2.5ml/班，0.1ml/组 六、实验方法及步骤 1