禽白血病综述及PCR技术探讨PPT.ppt

动物疫病监测培训班 禽白血病流行病学及防控 1 荧光PCR检测技术及应用 2 POCKIT现场PCR检验系统 3 内容提要 核酸自动提取仪的应用 4 第一章 禽白血病流行病学及防控 禽白血病毒（ALV）是一种反转录病毒，类似于人的艾滋病毒。 传播方式：垂直传播、横向感染、昆虫、针头、活疫苗污染。 ALV分类（亚群）：A，B，C，D，E，J，K。近两年J亚群在临床上的分离率较高。 净化鸡群，主要指的是净化外源性病毒。所谓外源性病毒，是指不会通过染色体传递的ALV，主要包括A、B、J亚型，这些亚型的病毒致病力较强。 禽白血病流行病学概述 禽白血病 囊膜糖蛋白（gp85） 它是区别亚群的抗原。常见的A、B和J亚群ALV感染后的鸡，可用对应的抗体检测试剂盒检测选。 主要衣壳蛋白（群特异性抗原，p27） 不同亚型间区别不明显，它可用来初步检测ALV，如ELISA检测。但无法区别致病性外源性病毒和无致病性内源性病毒。 ALV的主要抗原蛋白 检测种鸡所产种蛋中p27抗原阳性率。 1.必须保证检测的蛋样≥100只。 2.需在开产及高峰，孵化前采集。 3.阳性率＞1%即为高风险。不合格。 4.样品抽取的随机性。 ALV感染风险评估体系 1.血清学检测 优点：方法简单、可大量操作。 缺点：无法鉴别诊断，有时会与E亚群交叉反应。 用途：流调、净化状态判定、SPF鸡群的感染情况 试剂盒选用：IDEXX 2.ALV-p27抗原检测 优点：方法简单、可大量操作。 缺点：无法区别内源外源病毒，会导致假阳性。 用途：出壳雏鸡肛拭子检测。 试剂盒：IDEXX、中监所。 ALV检测方法 2. 3.核酸检测法 用PCR（RT-PCR）结合特异性核酸探针做分子杂交，直接检测样品中有无A、B、J群的病毒核酸。 优点：直接检测病毒，灵敏度高，特性性高。 缺点：操作人员需要有一定的操作基础，无法得到病毒。 如何选用适合的检测试剂盒？ 用不同滴度的抗原盲测，选出最敏感的。 同一品牌不同批次的试剂盒进行筛选。 ALV检测方法 第二章 荧光PCR检测技术及应用 1、灵敏度高 荧光PCR由机器检测扩增物，最少可检出0.1ng扩增产物。 普通PCR结果由肉眼检测，至少需要100ng产物才能判定结果。 2、人为污染小 荧光PCR无需开盖，全程使用仪器运作，PCR结束即可得到结果，避免气溶胶污染造成的假阳性。 普通PCR需要打开PCR管盖，取出产物进行电泳，容易污染。 3、效率高，可相对定量 避免电泳和溴化乙锭染色，生物安全度高，荧光PCR仪出结果速度也更快。另外可以进行定量分析。 荧光PCR的优点 阈值设定原则 阈值线设定于刚好超过阴性对照扩增曲线的最高点。不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整。 结果描述及判定 阳性对照CT值≤30并出现特定的扩增曲线，阴性对照无CT值并且无特定扩增曲线，视为有效结果。 30＜CT≤35并出现特异曲线，需要重新做。若结果仍为可疑，可判定阳性。 CT值＞35时，超过本方法范围，视为阴性。 对于某些未呈现S曲线，但本底较高的样品，视为阴性。 荧光PCR检测结果条件设置（元亨） 分为两类产品 1、禽病诊断试剂盒 禽流感试剂盒：通用型、H5亚型、H7亚型、H9亚型。 新城疫诊断试剂盒。 2、猪病诊断试剂盒 口蹄疫通用型、蓝耳病通用型、高致病性蓝耳病、猪瘟、猪圆环2型、伪狂犬试剂盒。 凯杰生物工程公司产品 第三章 POCKIT现场PCR检验系统 产品特点 chanpin 1、便携性高 2、操作简单 3、反应时间短 4、灵敏度高 5、投入成本低 操作简单、判读结果直观 POCKIT产品与传统PCR的比较 POKIT 传统PCR 操作时间 1.5小时 3-5小时 设备所需空间 办公室或者简易 实验室 较大的独立空间 PCR产物 污染问题 无 风险较高 人员素质需求 看说明书即可操作 需具备分子 生物学知识 * *