大肠杆菌细胞转型.docVIP

第九章 大腸桿菌細胞轉型 (氯化鈣轉型法) 課前提示 細胞轉型是這系列分生實驗的總結，這也是遺傳工程實驗的重要步驟。將 DNA 送入細胞中有兩個重要的意義：第一、利用細胞內正確率較高的複製機制來大量複製與保存一段基因；第二、在基因前方配合適當的啟動子就可以在細胞中表現該基因所代表的蛋白質。請注意原理講解時助教所補充的相關應用。 轉型率的單位通常是指每 ng 的質體能產生多少個菌落形成單位 (colony formation unit, cfu)，轉型率越高表示細胞轉型的操作愈成功。注意本實驗中的細節，它可能都是會影響轉型率的重要因素。 轉型成功的任何細胞與實驗廢棄物都必須滅菌處理之後方可丟棄，以造成生態的基因污染，這是操作遺傳工程實驗的重要守則。 實驗原理 大部分的細菌都有能力從周遭環境 (培養基) 中吸收 DNA 的能力。但是通常來說，被細菌吸收進去的 DNA 往往會被當成營養物質而被分解成細菌所需的小分子。但是有時候這些 DNA 也有可能被完整的留在細菌體內，並隨著細菌的複製而長久的留存在這群細菌之中。而如果被細菌吸收的 DNA 是所謂的質體 (plasmid) 那它就更有機會能留在細菌體內了。如同我們在第七章所介紹的，質體 DNA 是一個小型的環狀 DNA。由質體帶有一段特殊的 ori 區域，能讓細菌內的 DNA 複製酵素認識而在複製細菌染色體的同時也順便將質體複製以傳給每一個分裂後的細胞。因此，ori 的種類與寄主細胞 (host cells) 內的 DNA 複製系統能不能相符就是質體 DNA 能不能在這個系統中生存的第一個考驗了。質體要成功在細菌中生存的第二個考驗就是我們曾在上課所介紹的細菌防衛系統，限制-修飾系統。每種細菌內都會有特殊的限制脢，會在特定的序列 DNA 上作切割。但由於其本身的染色體上相對應的序列皆以甲基化保護而不會受影響，只有外來的 DNA 如噬菌體或質體才會被破壞。因此質體如果要成功的存活在某種細胞中，就必須符合其限制-修飾系統。 將一段外來的 DNA 送入細菌細胞中，不論該細胞是否會因此產生何明顯的性狀改變，就稱為細胞轉型 (transformation)。而現在這個定也擴大到真菌、植物和動物細胞。隨著生物科技的發達，細胞轉型的技術也更加便利了。標準化的大腸桿菌寄主細胞與各種質體都經過改良，你不必擔心上述提到的相容問題而只要依照廠商的說明書操作就可以成功的將質體轉型進入細菌之中。 現在我們有了相容的寄主細胞以及質體 DNA 作為載體，我們可以用限制脢將載體剪剪貼貼加入其他我們要的 DNA，就可以“夾帶”送進細菌中了。那麼我們是不是直接把重組的質體加在培養基中，細菌就會乖乖的把它們吃進去呢？如果你這樣作實驗，那結果可能會很令你失望。我們雖然提到細菌有吸收外界 DNA 的能力，但是這畢竟不是細菌獲取遺傳物質的正常途徑，也因此其自然發生的比率很低，幾乎沒有實用的價值。為了提高細菌轉型的效率，我們必須先對寄主細胞進行一些物理或化學的處理，讓它更容易吸收我們的質體，這樣的處理過的寄主細胞又被稱作勝任細胞 (competent cells)。 以鈣離子溶液來處理大腸桿菌，使常用來製造勝任細胞的方法。這種方法的原理目前仍然不清楚，但推測是鈣離子有助於將質體 DNA 沈澱於細胞表面。經過一段時間培養後，給予細胞短暫的熱刺激 (heat shock at 42℃)，可使質體移動進入菌體中，而這也是這門課所要讓大家練習的方法。除了氯化鈣轉型法之外，常用於細菌細胞轉型的方法還有電破轉型法 (electroporation)。 即使寄主細胞變成了勝任細胞，我們也不能保證每個勝任細胞都能成功的接受 DNA 而轉型。因此我們需要一種能分辨轉型成功與否的篩選方法，抗生素篩選就是一個很好的方法。我們常選用含有分解 ampicillin 抗生素基因的質體作為載體用來轉型無法在 ampicillin 下存活的寄主細胞。如果寄主細胞成功轉型，則表示質體已經可以在菌體中開始複製，其上所帶的抗藥基因也會同時發揮作用，因此能在含有抗生素的培養基上生長就是我們要的成功轉型菌株。 實驗材料與儀器 每群公用藥品 菌體：JM 109每群 1 ml。助教需在實驗前一天下午四時半前至實驗室，依群別分別接種一菌落於 1 ml LB 培養液中，置 37℃ 快速振盪培養一夜。 LB 培養液：每群三瓶配法為：2 公升水溶液中含 20 g Tryptone, 20 g NaCl, 10 g Yeast extract, 以 NaOH 調至 pH 7.5, 分裝成每瓶 25 ml 裝在 250 ml 三角瓶內，經高壓滅菌處理。 混合液 A：50 mM CaCl2, 10 mM Tris-Cl ( pH 8.0 ), 600 ml。配製後經高壓滅菌處理，實