《基因工程》第三章 载体2.pptVIP

《Princple and Technology of Genetic Engineering》《基因工程原理》; 第三章 基因工程载体 ; 第一节 载体的定义 ;载体应该具备记到主要条件，以pBR322为例进行说明： 1 克隆位点：在DNA分子合适的位置有1到多个克隆位点，可供外源DNA片段插入克隆载体DNA分子中。 2 复制起点：具有复制起点，外源DNA插入载体后，仍可从复制起点起始复制过程。 3 筛选标记基因：具有用于选择克隆子的标记基因。;pBR322为例说明负筛选法：首先用不含AP和TC的培养基，两种都长，然后选取一些菌落，在含AP的培养基上培养，不长的，说明有外源基因插入AP位点，到不含AP和TC的培养基的培养基上找到相应的点。;第二节 质粒载体（Plasmid vectors） ; 质粒的命名：p，plasmid表示质粒，随后的两三个大写字母表示谁发现和发明了该质粒，数字表示质粒分离的次数或者构建的一系列质粒的编号。 例：pBR322;二、质粒克隆载体 质粒经改造后即可成为基因工程载体。如前述pBR322，载体需有克隆位点和标记基因。标记基因种类很多： 1）抗性标记基因（可直接用于选择转化子） a.? 抗生素抗性基因: Apr ，Tcr ，Kanr，G418r，Hygr ，Neor b. 重金属抗性基因: Cur ，Znr ，Cd r c. 代谢抗性基因: 抗除草剂基因 2）营养标记基因（可直接用于选择转化子）。主要是参与氨基酸，核苷酸及其他必需营养物合成酶类的基因， 这类基因在酵母转化中使用最频繁，如TRP1，URA3，LEU2，HIS4等。 3）生化标记基因。其表达产物可催化某些易检测的生化反应，如lacZ, GUS, CAT。 ;葡萄糖苷酸酶基因（GUS） 该基因编码一种可分解各种β-葡萄糖苷酸酶基因衍生物的水解酶。该标记基因除具有上述lacZ基因的优点外，它的适用范围十分广泛，因为许多生物中没有这种基因。 荧光素酶基因 荧光素酶或由萤火虫产生的可催化蜜蜂荧光素氧化的酶，并产生荧光，若在反应中加入CoA，可使灵敏度提高10倍；或由发光细菌（Photobacterium fischeri）产生的荧光素酶，它与FMN-氧化还原酶联用，通过NAD(P)H的变化测定酶活。 发光蛋白质基因 发光蛋白是由水母产生的一种可发光的蛋白质，该蛋白质可使大肠杆菌菌落??蓝色。; β—半乳糖苷酶基因（lacZ 和lacZα） β—半乳糖苷酶基因有1021 AAs，基因产物不具酶活性，装配为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为两部分：α链和β链。前者负责四聚体装配，后者具β—半乳糖苷酶活性；只有当两者都存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为α-互补作用。这两个部分可独立存在， 分别由两个基因编码。为α链编码的基因称之为lacZα(编码145 AAs)。这两个基因（LacZ和LacZα）均可作为标记基因。 β—半乳糖苷酶基因的优点: a.?酶催化X-Gal水解为兰色产物，检测直观 b. lacZα编码5-端可容许很大的变化而不影响酶活性 c. lacZα和β链基因的分别表达可使载体小而容量大;三、构建质粒克隆载体的基本策略（Slightly more exotic plasmid vectors） 1 能在转化的受体中进行有效复制、有较多拷贝数（松弛型的质粒ori）。 2 克隆位点：尽可能多一些，至少有一个。可用 MCS连杆，MCS是指含多种内切酶识别序列的多克隆位点（multiple cloning site），又称多聚接头（polylinker）。 3 筛选标记基因：选择标记区内有合适的克隆位点，当外源DNA插入时，标记gene将失活而成为筛选的标识。 4 构建的质粒克隆载体应尽可能小。大于15kb的plasmid转化效率明显。 5 根据需要，使构建的质粒克隆载体组装各种“元件”（小DNA片段）。如插入启动子，终止子。;Puc18/19克隆载体： 1. 2.68kb 2.ori来源于松弛型质粒ColE1的复制起始位点，可在大肠杆菌E.Coli HB101,E.Coli C600等细胞中高效复制（DH5α）。 3.含报告基因LacZ，lacZ取代了pBR332中的Tcr基因。; P LacZα LacZβ;pUC系列质粒载体由Messing et al.构建，具有三个显著特点： 1.分子量小，仅为2.7KB，容纳外源DNA量增大 2.易于检测是否有外源DNA插入的标记基因LacZα 3.多克隆位点区 1) 多克隆位点成对地存