z2.1-8第二章 基因工程(1-8).ppt

基因工程制药;第二章 基因工程制药（8学时）;用途：主要用于癌症、人类免疫缺陷病毒性疾病、心血管疾病、糖尿病、贫血和许多遗传疾病的治疗。 获取方式：生化提取 基因工程表达 ;1982年世界上第一个基因工程药物 ― 重组人胰岛素获准生产销售，至今已有 100 多个生物技术药物上市; 促红细胞生成素（EPO）以全球销售额 38 亿美元的业绩，居全球最畅销 10 种药物的第6名； 美国是现代生物技术的发源地，一直稳居生物技术药物研发榜首,其 2002 年产值和销售额已超过 200 亿美元; 1989年我国第一个拥有自主知识产权的基因工程药物 -- 重组人干扰素（IFN–α1b）上市以来，目前，世界上销售额排前 10 位的生物技术药物我国已能生产8种。;第一节 概 述; 应用基因工程技术可十分方便且有效地解决传统生物制药所遇到的问题，从量、质上都可以得到改进，且可以创造全新物质。 如今，癌症、病毒性疾病、心血管疾病以及内分泌等方面的预防、治疗和诊断均可通过基因工程技术获得。;第二节 基因工程药物生产的过程;基因工程药物生产的上游和下游;获得目的基因;基因工程基本过程;第三节 目的基因的获得;逆转录法的步骤 1、mRNA的纯化 2、cDNA第一链的合成 3、cDNA第二链的合成 4、cDNA克隆 5、将重组体导入宿主细胞 6、cDNA文库的鉴定 7、目的cDNA克隆的分离和鉴定;cDNA克隆示意图;1、mRNA的纯化;3、cDNA第二链的合成;4、cDNA克隆;5、将重组体导入宿主细胞;6、cDNA文库的鉴定;7、目的cDNA克隆的分离和鉴定;分离得到含有目的基因的阳性克隆后，必须对其作进一步的验证和鉴定（限制酶图谱、基因测序等）。 ; 三、化学合成法 较小的蛋白质或多肽的编码基因可以用化学合成法合成。 必须知道目的基因的核苷酸顺序或目的蛋白质的氨基酸顺序。 人工化学合成的限制：一不能合成太长的基因，50～60bp；二是人工合成时，遗传密码的简并性可导致中性突变；三是费用较高。;第四节 基因表达;一、宿主细胞的选择; 宿主细胞常用两大类： 原核细胞：常用有大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、链霉菌等； 真核细胞：常用有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。 ;1、原核细胞; ⑵枯草芽胞杆菌： 分泌能力强，蛋白质不形成包含体。产物蛋白质不能糖基化。有很强的胞外蛋白酶对产物降解。 ⑶链霉菌： 作为外源性基因表达受到重视。不致病、使用安全、分泌能力强、表达产物可糖基化。 ;2、真核细胞; ⑵丝状真菌 优点：分泌能力强，能正确进行翻译后加工（肽剪切、糖基化）有成熟的发酵和后处理工艺。 ⑶哺乳动物细胞 优点：表达产物可由重组转化细胞分泌到培养液中，纯化容易。产物是糖基化的接近天然物。 缺点：生长慢，生产率低，培养条件苛刻，费用高，培养液浓度稀。 ;二、大肠杆菌体系中的基因表达（了解）;（4）应具有阻遏子，使启动子受到控制，只有当诱导时才进行转录。 外源基因的高效表达往往会抑制宿主细胞的生长、增殖，而阻遏子可使宿主细胞免除此不良影响 （5）应具有很强的终止子，以便使RNA聚合酶集中力量转录克隆的外源基因，而不转录其他无关的基因，同时，很强的终止子所产生的mRNA较为稳定。 （6）所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号，即起始密码AUG和SD序列,以便转录后能顺利翻译。 如：在大肠杆菌中表达非融合蛋白的操纵子必须改建成：细菌启动子 — 细菌SD序列 — 起始密码子 — 结构基因 — 终止子。 ;常用的载体有质粒、噬菌体和病毒等 质粒载体 质粒（plasmid）是细菌或细胞染色质以外的、能自主复制的、与细菌或细胞共生的遗传成分。其特点如下： ①染色质外的双链共价闭合环形DNA。自然形成超螺旋结构，不同质粒大小在2～300kb之间，＜ 15kb的小质粒比较容易分离纯化，＞15kb的大质粒则不易提取。 ②能自主复制。 ③质粒对宿主生存并不是必需的。;质粒(plasmid ) 的生物学特性 独立于染色体外能够进行自我复制的双链DNA分子。;常用表达载体 pBV220系统; pBV220系统优点： ① cIts857阻遏子基因与PL启动子同在一个载体上，可以转化任何菌株，以便选用蛋白酶活性较低的宿主细胞，使表达产物不易降解。 ② SD序列紧跟多克隆位点，便于插入带起始ATG的外源基因，可表达非融合蛋白； ③ 强的转录终止信号可防止出现“通读”现象，有利于质粒-宿主系统的稳定；;④ 整个质粒仅为3.66kb，有利于增加其拷贝数