表达猪瘟兔化疫苗株E0蛋白的PK15细胞系构建研究.pdfVIP

制品研究、生产、应用及管理 1．材料 之一接种生产用毒种，转瓶先放37℃培养24小时， 1．1．细胞BHK21细胞，来自中国兽医药品监察所。 之后转为33．5—34。C继续培养，接毒后72小时将培 1．2种毒狂犬病弱毒Flury株，来自中国兽医药品监养液PH调整为7．4，至接毒后102。120小时收获， 察所。生产用毒种为自行繁殖，毒种LDso为反复冻融2次，混合后抽样待检。 105·o一5～／0．03ml。 2．4异步接毒细胞传代24小时后长成良好单层，弃 1．3主要试剂及溶液MEM购自GIBCO公司，胰蛋白去培养液，按培养液的1％接种生产用毒种，吸附1 小时，加入含3％犊牛血清的维持液，放33．5．34℃ 酶购自GIBCO公司，L一谷胺酰氨购自SIGMA公司， 犊牛血清购自大连旅顺天娥检验试剂厂，双抗自己 培养，接毒后48小时将培养液PH调整为7．4，至接 配制1万单位／ml。 毒后96—120小时收获，反复冻融2次，混合后抽样 待检。 1．4实验动物11—139小白鼠，购自北京实验动物 中心。 2．5配苗冻干取两种不同接毒方法检验合格的抗 2．方法 原，分别同5％蔗糖牛奶等量混合，每瓶分装2．5ml， 按常规方法冻干。 2．1细胞传代将生长良好的BHK21细胞用EDTA一 胰酶进行消化，分散比例为1：4，用滤过除菌的MEM2．6效价测定按照《狂犬病活疫苗规程草案》…方法 为培养液，营养液中含8％的犊牛血清、3％的谷氨 接种小白鼠测定效价。 酰胺含量为1％、每毫升培养液中含双抗100单位，3．结果 同步与异步两种不同接毒方法冻干前后效价检验结 用7．5％碳酸氢钠调整PH为7．0—7．2，37℃转瓶培 养，每3天传代一次。 果都符合《狂犬病活疫苗规程草案》标准，半成品效 2．2细胞分组将1：4分散的细胞随机等量分成2 组，一组进行同步接毒，另一组供异步接毒使用。 2．3同步接毒将分散好的细胞，按细胞悬液的百分 结果见表1 表1、两种接毒方法的效价比较(原苗LDse／0．03ml。成品LDso／头@) 毒种效价 105。o 105‘o 105·0 105·0 105·0 l旷·0 105·0 1旷·0 原苗效价 105‘25 105‘o 105·笛105·0105·0 105·5 l矿·O 104·75 成品效价 104·竹 104·5 104·75 104·25 104·5 104·75 104·5 104·25 两种接毒方法原苗和成品效价测定结果经t检 异。这与狂犬病毒不致细胞病变且适合同步接毒的 验P0．05，差异不显著。 报道相一致[2]，在生产过程中应用该工艺可以简化 4、讨论与结论 生产过程，降低生产成本。 4．1测毒结果表明，同步与异步接毒抗原效价无明 参考文献 显差异。 [1】中华人民共和国农业部．中华人民共和国兽用生物制品规程 [M]．北京：中国农业出版社。2001．7．11 4．2细胞观察结果表明，感染狂犬病毒的BHK21细 [2]殷震刘景华主编．动物病毒学第二版[M]．北京：科学出版社。 胞，无论其发育形态，分裂速度，细胞形态，细胞老化