显微镜的七种观察方法.ppt

三色滤色镜的特性曲线 激发 分色 吸收 双重染色标本的单色和双色观察 WU WIB DUAL BAND WIBA WIG WIB DAPI+FITC FITC+PI 单色滤色镜的特性曲线 双色滤色镜的特性曲线 现行显微镜特点和各种滤色镜 自由组合 激发块 吸收滤色镜 激发滤色镜 分色镜 油镜应使用荧光油 物镜光栏的运用 光栏全开启 光栏适当关小 减少杂散光干扰 荧光的衰减 防衰减的方法 使用抗衰减剂 选择衰减小的荧光素 降低激发光强度 降低标本中氧的浓度 有衰减的标本 使用抗衰减剂的效果 汞灯灯箱构造 灯室，上下、左右旋钮，聚光镜旋钮 按观察方法分 7-4 4.偏光:有些物质在两个呈一定夹角的偏光滤片之间可现呈鲜明的对比，或根据双折射性能和定向呈现颜色 偏 光 1 原理 依据波动光学原理观察和精密测定标本细节,或透明物体改变光束的物理参数,以此判别物质结构的一种显微镜 自然光（多振动面） 偏振器1 偏振器2 偏振光（单一振动面） 各向同性：单折射体，光性质不因照射方向而改变，普通气体、液体、非结晶固体等 各向异性：双折射体，光速度、折射率、吸收和振动面、振幅随照射方向不同，晶体、纤维等 应用：矿物质、化学物品鉴别 鉴别纤维、染色体、淀粉粒、细胞中晶体 植物病理检验 鉴别骨骼、牙齿、胆固醇、神经纤维、肿瘤细胞、横纹肌和毛发等 偏光显微镜主要用于检测矿石,地质大学会用到,特别是可以用来鉴定珠宝,另外可以检测生物内骨骼,这个我还没有遇见实例,还可以检测生物化学结晶,化学院用来观察结晶液像,其他在纺织物品化学成分上检测上,物理芯片上等,凡是观察双折射晶体会使用偏光显微镜 。 按观察方法分 7-5 5.相衬（差）:利用光线通过分别处于聚光镜与物镜的一对互补的光环后产生干涉（强度叠加或减弱），即相位差转变成了光强差，从而可清楚观察到使原来不易看清的透明类样品（即相位物体，如活细胞）。 相 差（衬） 相 差（衬） 1 原理 利用被检物体的光程（折射率 x 厚度）差进行镜检，即利用干涉现象，将相位差变为人眼可以分辨的振幅差 共轭面：吸收光线，直射光通过 补偿面：相位推迟，衍射光通过 物镜相板 聚光镜环状光阑 2 特点 鉴定活体细胞最实用、最经济的方法 3 缺点 需要光强高 切片不能太厚(5~10um) 盖片、载片需符合标准 最好配用单色滤光镜 操作较麻烦 荧光效果不如明场物镜 ） 显微镜的七种观察方法 按观察方法分七种 明场 暗场 荧光 偏光 相差 DIC 霍夫曼 显微观察方式 按观察方法分 7-1 1.明场:照明光直接通过聚光镜入射于试样，并透过试样后进入物镜并最终被观察到。 明 场 暗 场 1 原理 丁道尔(Tyndall)现象，微粒对斜射光反射或衍射，增大了人眼可见性。 2 特点 观察到极其微小物体，分辨率可达0.02 ~ 0.004 um (明场0.4um)—”超显微“。 3 缺点 只能观察到物体存在、运动和外部形态 不方便调节 标本要求高（灰尘、盖片、载片） 4 应用：微小粒子、细菌形态观察、细菌记数，透明标本观察等 按观察方法分 7-3 3.荧光:利用某些物质在受到了紫外光或短波长的光激发照射以后能够发射出比激发光波长长的荧光的特性的观察方法 荧 光 什么是荧光 ? 物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光，是非温度辐射光——冷光。即：物质吸收短波光，发射出的长波光。 显微镜荧光利用光源激发——光化荧光 荧光的种类自发（固有）荧光 二次荧光 荧光的性质 吸收光，必需有激发光源 荧光波长＞激发波长（损失热能） 荧光强度极小于激发光的强度 有不同程度的衰减 荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、荧光效率 荧光显微镜的优点和用途 优点： 检出能力高（放大作用） 对细胞的刺激小（可以活体染色） 能进行多重染色 用途： 物体构造的观察——荧光素 荧光的有无、色调比较进行物质判别——抗体荧光等 发荧光量的测定对物质定性、定量分析 荧光显微镜的种类 透射式 荧光显微镜的种类落射式 荧光显微镜的主要部件 透射式 汞灯光源 激发滤色镜 吸收滤色镜 暗场聚光镜 落射式 汞灯光源 激发滤色镜 分色镜 吸收滤色镜 落射荧光显微镜的构造 吸收滤色镜 激发滤色镜 落射荧光显微镜的构造 荧光显微镜光源 汞灯光源: 提供激发光(U、V、B、G) 氙灯光源： 高峰值更宽，更稳定 荧光显微镜激发透镜组 激发滤色镜: 激发波长选择