流式细胞术的应用(高艳红).pptVIP

流式细胞术的应用（Flow Cytometry,FCM) 1、流式细胞仪(Flow Cytometer):是集光电子物理，光电测量，计算机，细胞荧光化学，单抗技术为一体的高科技细胞分析仪。 2、流式细胞术(Flow Cytometry):利用流式细胞仪对处于快速流动的细胞或生物颗粒进行多参数、快速（每秒可达1000-10000个）的定量分析和分选（纯度可达99%以上）的技术。 流式细胞仪的基本原理 流式细胞仪的应用 流式细胞仪的操作 流式细胞仪结构 流动室及液流驱动系统:鞘液 激光光源及光束形成系统:透镜、滤光片、小孔，聚焦光源 光电管和检测系统：收集不同波长的荧光信号，光电倍增管（PMT）、补偿电路，荧光信号转换为电信号，并将信号放大 计算机和分析系统 流式细胞仪的主要技术指标 1．流式细胞仪的分析速度：一般流式细胞仪每秒检测1000～?5000个细胞,大型机可达每秒上万个细胞。 2．流式细胞仪的荧光检测灵敏度：一般能测出单个细胞上600个荧光分子,两个细胞间的荧光差＞5%即可区分。 3．前向角散射（FSC）光检测灵敏度：前向角散射（FSC）反映被测细胞的大小,一般流式细胞仪能够测量到0.2μm～０.5μm。 4．流式细胞仪的分辨率：通常用变异系数CV值来表示，,一般流式细胞仪能够达到2.0%,这也是测量标本前用荧光微球调整仪器时要求必须达到的。 5．流式细胞仪的分选速度：一般流式细胞仪分选速度＞1000个/秒，分选细胞纯度可达99%以上。 流 动 室（flow cell） 光 路 激光 根据被激发物质的激发光谱而定 滤片 长通滤片 – 允许长于设定波长的光通过 短通滤片 – 允许短于设定波长的光通过 带通滤片 – 允许一定带宽的波长的光通过 带阻滤片 – 阻挡一定带宽的波长的光通过 二向色性滤片( dichroic filter)： 当以 45o 角放置滤片时,该滤片可以通过一定波长的光, 同时也可以阻断并折射该波长以下的光。 常用荧光染料的特性 散射光信号—前向散射光(FS) FSForward (Angel Light) Scatter 在激光束正前方的检测器, 为前向散射光检测器 FS的强度主要与细胞或其他颗粒的大小有关 散射光信号 – 侧向散射光 SS-Side (Angel Light) Scatter 与激光束垂直方向的检测器为侧向检测器, 也称为90度散射光检测器 SS反映被测细胞的细胞膜、细胞质、核膜的折射率和细胞内颗粒的性状，SS的强度与细胞或其他颗粒的颗粒度有关 二、流式细胞术的应用 细胞增殖周期测定和DNA倍体分析 凋亡检测 免疫功能的检测 血液学应用 HLA-B27的检测：用于诊断强直性脊柱炎 其他：溶液中细胞因子的测量 细胞分选 细胞增殖周期测定和DNA倍体分析 1）细胞增殖周期：分为G0、G1、S、G2、M期。FCM分析一个群体细胞峰DNA倍体与细胞周期时，将DNA含量直方图分为三部分，即G0/G1,S,G2/M期三个细胞峰。G0/G1和G2/M细胞峰DNA的含量成正态分布，S期细胞峰则是一个加宽的正态分布。 2）利用DNA的荧光染料，如PI（Propidium iodide碘化丙啶），与细胞内的DNA结合，可反映细胞内DNA含量。采用DNA直方图显示。具有2C DNA含量细胞为G0/G1期细胞，4C DNA含量细胞为G2/M期细胞，DNA含量介于两者之间的细胞为S期细胞。 3）DNA倍体：主要比较G0/G1期细胞DNA含量的变化。用DNA指数（DI）表示。 DNA指数=测量样本G0/G1期DNA含量/正常人淋巴细胞G0/G1期DNA含量 以正常人淋巴细胞作为对照。 正常细胞DNA指数为1.00，DNA指数＞1，为超2倍体，＜1为亚2倍体，两者可统称为非整倍体。非整倍体细胞中肿瘤的特异性标志，实体肿瘤中出现频率较高。 凋亡检测 1）FCM-DNA检测（DNA亚G1峰的检测）：利用PI染色，检测具有亚G1期DNA含量的细胞比例，代表凋亡细胞数。其原理为在凋亡过程中，细胞内核酸酶的释放，将DNA降解，分解成小的片段，在标本制备中的固定处理时，细胞膜的完整性被破坏，使细胞内降解的DNA片段从细胞内流出，造成总体DNA含量减少，成为亚2倍体。 注：检测的凋亡细胞数代表晚期的凋亡细胞比例，且易受标本中的死细胞和碎片的干扰，影响结果的准确性。 免疫功能的检测 （1）利用多参数流式细胞术，对PB中淋巴细胞比例，及淋巴细胞中T、B、NK细胞的比例，及T细胞亚群进行检测。如CD3+（总T细胞）；CD19+（总B细胞），CD3-/（CD16+5（NK细胞）。3+/CD4+（Th/Ti）：辅助/诱导；CD3+/CD4+/CD5RA+：na?