2011基因克隆的方法和原理.pptVIP

第十九章 基因操作 Chapter 19 Gene Manipulation 第三节 基因的克隆 Section 3 Gene Cloning 一、基因克隆中的工具酶 限制性核酸内切酶分类 限制酶的命名 EcoRⅠ E 代表Escherichia属 co 代表coli 种 R 代表RY13株 I 代表该菌株中分离的第1个限制酶 II类限制酶的底物识别顺序及切割位点 识别顺序 绝大多数的II类限制性内切酶在底物DNA上的识别 顺序为4~8个核苷酸回文序列（Palindromic） Hare III 5’-GGCC- 3’ BamH I 5’-GGATCC-3’ 3’-CCGG- 5’ 3’-CCTAGG- 5’ “怪才”李南阳的回文诗 转化 感受态细菌主动或被动摄取外源DNA的过程 热激法是最常用的转化方法 CaCl2处理，增加细胞壁通透性(0-50C) ，得感受态细菌 420C将细菌与重组的质粒DNA温育 第四节 克隆基因的表达 Section 4 Gene Expression pBV220、pET等，商品化供应 结构特点： 携带克隆基因的表达载体，在原核生物中表达所必备的表达调控序列： 启动子 终止子 核糖体结合位点RBS（SD序列） 其他调控序列 表达质粒载体pET的结构 原核细胞表达系统的优缺点 优点： 表达系统简单，容易操作 成本低，易于大量生产 生长周期短 缺点： 需要翻译后修饰的蛋白，不能用此表达系统 二、真核细胞表达载体 质粒载体和病毒载体 调控表达元件最初多来源于病毒 将重组真核载体导入真核细胞的过程称为基因转染 真核细胞表达系统的优缺点 优点： 可表达需要翻译后修饰的蛋白（糖基化修饰） 高雪病（葡糖脑苷脂沉积病）：缺乏β－葡萄糖脑苷脂酶 ，吞噬糖脂的巨噬细胞使肝脾肿大 缺点： 表达系统相对复杂 成本高 生长周期长 第五节 基因结构的分析及改造 Section 5 Gene Structure Analysis and Modification 质粒DNA的分子构型和电泳模式图 松弛开环线性的L构型 松弛半开环的OC构型 超螺旋的SC构型 L SC OC Characters of plasmid vector： 复制子：能在宿主细胞内携带目的基因扩增 筛选标志：如抗药基因等(Ampr, Lac Z） 限制性内切酶位点和多克隆位点(MCS) 调控序列：表达载体必备 质粒可容纳10kb的外源DNA片段 三、基因克隆的必要条件 目的基因：原核、真核基因… 克隆载体：质粒、病毒载体… 工具酶类：内切酶、连接酶… 宿主细胞：细菌、动物细胞… 四、基因克隆的基本步骤 ① 酶切：制备目的基因和载体 ② 连接：目的基因和载体的连接 ③ 转化：重组的DNA导入受体细胞 ④ 筛选：DNA重组体的筛选和鉴定 基因克隆步骤：切、接、转、筛 （1）目的基因的获得 PCR、RT-PCR、基因组或cDNA文库、人工合成 （2）载体的选择 （3）目的基因与载体的连接 粘性末端、人工接头、同聚体尾、平端连接 粘性末端连接 阻止载体自连 定向克隆 人工接头--Linker 人工接头--Adaptor 同聚体加尾 平端连接 （4） 重组DNA导入宿主细胞 转化（transformation） 转导（infection） 转染（transfection） 热激法转化感受态的过程（play） （5） 重组DNA的筛选鉴定 遗传学方法：抗生素、蓝白斑筛选 核酸杂交法 菌落PCR法 免疫学方法 双抗生素筛选： PLAY Blue-White Screening： α互补：载体具有lacZ的调控序列和氨基端编码区，宿主 细胞具有lacZ的羧基端编码区 IPTG存在时β-半乳糖苷酶将底物X-Gal转化为蓝色产物， 得到蓝色菌落 载体的多克隆区域，克隆上插入片段导致α-肽编码区的 破坏，使β-半乳糖苷酶失活，得到白色菌落 表达系统： 原核细胞表达系统： 大肠杆菌 真核细胞表达系统： 酵母、昆虫、中国仓鼠卵巢细胞（Chinese Ha