龙眼梅PGIP+cDNA的克隆及序列分析.pdfVIP

龙眼梅PGIPcDNA的克隆及序列分析水 王家福…朱春林”陈桂信2潘东明2·+ (1．福建农林大学园艺植物生物工程研究所，2．园艺学院，福州，350002) 摘要：阻龙日艮梅(Prunusm¨聃eSieb PCR扩增的目的片段用1％琼脂糖凝胶电泳检测后，进行回收、转化，通过蓝白斑筛选挑取白色菌落，进 cDNA的序列全长为1045bp。 行菌液PCR鉴定，确定重组子后测定全序列。测序结果显示，龙眼梅的PGIP 关键词：龙眼梅：PGIPeDNA；克隆：DNA测序 值高，被誉为保健食品，深受国内外消费者的喜爱。龙眼梅的果实因含酸量较高，很少用于鲜食，大 部分用于加工，但由于果实采后迅速软化，给贮返和加_[带来很大的困难，尤其是交通不便的山区， 果实采收后，冈果实的软化，在加T前出现品质下降，甚至大最腐烂，给生产带来很火的经济损失。 冈此，选育出抗软化和抗病虫害的龙眼梅品种是急需解决的问题，也是解决龙眼梅果实软化的主要途 径之一。 多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(Polygalacturonase 的蛋白质家族成员之一，能够非竞争性地抑制多种植物病理性真菌的内聚半乳糖醛酸酶 加植物的抗毒素，激活植物的防御系统。PGIP基因可以干扰灰霉菌等多种真菌病害对植物组织的侵染 过程，从而抑制这些真菌病害的发生例。PGIP基因还与果实的发育过程、胁迫反应、冷藏、浆果果实 的病虫害等有关[4。1。因而，PGIP基因受到国内外研究者的高度重视并成为目前抗病虫害基因工程和 果实耐贮藏基因工程研究的焦点。 本文以龙眼梅为材料，对PGIPcDNA进行克隆和测序，为进一步开展转基因育种工作奠定了基础。 1材料与方法 I．I材料 植物材料龙眼梅嫩芽采自福建农林大学校园，液氮速冻，放一70℃冰箱保存备用。自制人肠杆菌 DH5ct；载体pGEM@-TEasy 司。 由上海生工生物工程公司测序。 1．2方法 1．2．1总RNA的提取及纯化 总RNA的提取采用Trizol提取试剂盒 1．2．2eDNA第一链的合成 照使用说明书。 1008) +基金项目：国家‘948”资助项目(991029)；福建省科技项目(2001 corn ”通讯作者。E-mail：pdm66@sina 1．2．3RT--PCR反应体系及程序 系：10xPCR 14．7p1。扩增程序为：预 1．2．3目的片段回收与克隆 PCR产物经1％琼脂糖电泳分析后，用玻璃奶法回收片段(操作步骤见北京原平皓公司产品说 性培养基上进行蓝白斑筛选，挑取白色菌落，摇菌做菌液PcR进行初步鉴定后测序。 2．结果与分析 2．1基因组DNA的提取结果 以龙眼梅的嫩芽为材料，采用改良的CTAB方法提取的基因组DNA沉淀呈白色、半透明。 2100 在Ultrospec OD260=0．041，OD280=0．020，OD260／OD2so=1．96 DNA含量=O．42¨虮1． DNA电泳后在凝胶成像仪上拍照结果如图1。 图1龙眼梅基因组DNA电泳图 图2龙眼梅RNA电泳图 GenomieDNAofPrunusmume RNA Fig．1 Fig．2 ofPrunusmumeSieb． Sieb．byagarosegeleleetrophoresis byagarosegeleleetrophoresis 2．2总RNA的提取结果 OD26dOD230=2．14，OD260]OD280=1．8l，其浓度为2．13蚓一 总RNA电泳后在凝胶成像仪上拍照结果如图2。 2．3龙眼梅基因组DNA的PGIP片段的获得 度大、无引物二聚体。 图3龙眼梅PGIPDNA克隆的凝胶电泳 图4龙眼梅PGIPcDNA克隆的凝胶电泳