IL-9 对弥漫大B 细胞淋巴瘤的调控及其机制的研究分析.docVIP

精品论文 参考文献 IL-9 对弥漫大B 细胞淋巴瘤的调控及其机制的研究分析 南朝阳（辽宁省大连市金州新区第一人民医院 116100） 　　【摘要】 目的探讨IL-9对弥漫大B细胞淋巴瘤细胞增殖与凋亡及其机制。方法应用Western blot检测了淋巴瘤细胞株LY1及LY8中IL-9R的表达，用IL-9处理淋巴瘤细胞株LY1及LY8，采用Brdu掺入法检测细胞增殖，采用Annexin V-FITC/P流式细胞术检测细胞凋亡；利用实时定量PCR检测JAK-STAT信号通路相关基因(BCL2L1，BAX，p21CIPl，PIMl，MYC以及MCL) 的变化情况。结果瘤细胞株LY1及LY8中IL-9R在蛋白水平有表达，IL-9能促进LY1及LY8细胞的增殖并抑制其凋亡； p21CIPl在LY1及LY8细胞的表达均上调，BCL2L1，BAX，PIMl，MYC以及MCL基因的表达无明显的变化。结论IL-9能通过上调弥漫大B细胞淋巴瘤细胞中P21CIP1蛋白基因的表达促进瘤细胞的增殖并抑制其凋亡。 　　【关键词】 弥漫大B细胞淋巴瘤；IL-9；细胞增殖; 细胞凋亡【中图分类号】 R2 【文献标号】 A 【文章编号】 2095-7165(2015)12-0110-01 　　弥漫性大B淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)是临床最常见的非霍奇金淋巴瘤，其发病率约为7~8例/10万人次，且在近10年间呈逐年增长趋势。国际上公认的治疗该病的治疗方案为为利妥昔单抗的(R-CHOP)方案，但在用药过程中容易出现耐药或疾病复发以及出现心律失常、肝功能衰竭、支气管痉挛、低血药呼吸困难等严重并发症，影响了治疗效果[1]。本研究以DLBCL细胞株LY1及LY8为研究对象，检测IL-9对细胞增殖和凋亡影响，IL-9对JAK-STAT通路下游细胞调亡基因的变化，进而初步探讨IL-9影响DLBCL细胞生物学行为的机制。 　　1 材料与方法1.1 材料DLBCL细胞株LY1及LY8由本实验室保存，RPMI-1640培养基、胎牛血清(fFBS)、IMDM 完全培养基、碘化丙啶、Brdu细胞增殖检测试剂盒、细胞凋亡双染检测试剂盒与DMSO均购自美国Sigma公司。 　　兔抗人IL-9R多克隆抗体购自美国abeam公司，人重组IL-9为美国Peprotech公司产品。BCL2L1，BAX，p21CIPl，PIMl，MYC以及MCL单克隆抗体试剂盒购自北京中山生物技术有限公司。 　　1.2 方法1.2.1 细胞培养LYI、LY8细胞株采用含 10%胎牛血清(FBS)、青霉素(l00U/ml)及链霉素(l00tng/ml)的 IMDM 完全培养基于37℃、5%CO2、饱和条件下培养。所有实验均选取对数生长期的细胞。 　　1.2.2 Western-blot检测蛋白表达取对数生长期的LYI、LY8细胞，加入蛋白裂解液充分裂解细胞提取蛋白，70V 恒压电泳约30min，100V恒压电泳约 90~120min，5%脱脂奶粉，水平摇床室温封闭1.5h，特异性Ⅰ抗4℃摇床过夜，特异性Ⅱ抗摇床室温1h曝光。 　　1.2.3 Brdu掺入法检测细胞增殖取对数生长期的LYI、LY8细胞以1times;105/ml的密度接种于96孔板，每孔120?l的培养基。 加入IL-9，使其终浓度分别为0、20、40、60和80ng/mL，37℃孵育72h，加入10?l的Brdu稀释液，37℃孵育2h，96孔板离心(转速：300g)10min，弃去上清液，每孔加入l00?l的抗体工作液，室温放置90min，弃去上清，加入l00?l基底液，摇床3min，于Spectra Max M2酶标仪490nm测量吸光值。 　　1.2.4 Annexin V-FITC/PI双标记法流式细胞术测定细胞凋亡计数细胞，2times;105 cells/孔，收集IL-9浓度干预72h后的LY1及LY8细胞，1times;PBS洗涤后，加入5?l Annexin V-FITC混匀后，加入5?l PI溶液，室温避光孵育10min，上机检测。 　　1.2.5 实时定量PCR检测检测JAK-STAT信号通路相关基因收集浓度80ng/ml的IL-9干预72h后的LY1及LY8细胞，5times;105 cells/样本，提取RNA，逆转录后以反应物进行实时定量PCR扩增，应用2-△△Ct法相对定量分析目的基因。 　　1.3 统计学方法应用SPSS16.0统计软件进行数据统计分析，所有数据采用( plusmn;s)表示，采用t检验分析，结果以Plt; 0.05为有统计学意义。 　　2 结果2.1 细胞株中IL-9R的表达情况DLBCL细胞株LY1及LY8中IL-9R在蛋白水平有表达。 　　2.2