具有荧光探针的靶向肽_聚_醚_酰胺_制备及其肝癌细胞靶向性能研究.docx

具有荧光探针的靶向肽/聚(醚-酰胺)制备及其肝癌细胞靶向性能研究*宋春梅1，4亮1粱晟斌1钱旻2冰2余亦华3，4李建奇3，4张杜(华东师范大学1化学系2生物系3物理系4上海市磁共振重点实验室上海200062)摘要通过端氨基聚乙二醇PEG(Ⅰ)与二亚乙基三胺五乙酸二酐(DTPAA)开环合成新型端氨基聚(醚-酰胺)(PEG/DTPA)共聚物造影剂配体(Ⅱ)(Step1);Ⅱ的端氨基与偶联剂3-马来酰亚胺苯甲酸-N-琥珀酰亚胺酯(MBS)的活化端COOH反应，生成偶联剂/聚(醚-酰胺)MB/PEG/DTPA(Ⅲ′)(Step2);再通过Ⅲ′中MBS的CC双键与肝癌细胞靶向黏附肽FAM-AGKGTPSLETTPC-(SH)-COOH(FAM-13)上的巯基SH发生Michael加成反应(Step3)，合成含有荧光探针FAM(5-carboxyfluorescein)的肝癌靶向肽/聚(醚-酰胺)(FAM-13/PEG/DTPA，Ⅲ).用1H-NMR和13C-NMR等方法对共聚物进行表征.Ⅲ对正常肝细胞L-02几乎观察不到荧光现象，而对肝癌细胞BEL-7404则有很强的黄绿色荧光，Ⅲ对肝癌细胞有很强的靶向性.大分子配体Ⅲ可望用于制备大分子造影剂及靶向载体负载药物.关键词FAM-13/PEG/DTPA共聚物，荧光探针，肝癌靶向肽，配体基因治疗［1］是治疗肿瘤的强有力的方法之一.然而存在两个问题，一是基因不能靶向于目标细胞，二是在药物评价时采用传统放射性同位素标记存在放射性污染.采用载体负载基因可以解决上述问题，然而用病毒作载体存在安全问题，因此高分子载体成为研究重点.如果在高分子造影剂载体上连接对人体某一组织或器官具有亲和性的基团，那么就能增强组织或器官的靶向性，从而实现靶向治疗，并可通过磁共振方法跟踪［2，3］，该领域是近年来的研究热点.但要制备的造影剂与靶向基团顺利结合，必须先制得具有可反应官能团的配体.本文把端氨基聚(醚-酰胺)(PEG/DTPA，Ⅱ)共聚物与肝癌细胞靶向多肽FAM-13偶联，反应后多肽保持生物学活性，提出的MBS偶联方法具有普适性.并对共聚物进行了表征及靶向性对比实验.制备的产物可作为高分子造影剂、DNA药物或其他癌症药物的载体，以及利用半衰期长的造影剂［5］跟踪药物的释放及癌症治疗情况.1实验部分聚乙二醇(PEG3350，M=3350)、三氯化钆n(GdCl3，AR)和3-马来酰亚胺苯甲酸-N-琥珀酰亚胺(MBS)购自Fluka;荧光素FAM标记肝肽FAM-13(FAM-AGKGTPSLETTPC-(SH)-COOH，华大天源多肽公司定做);无水乙醇(CP，上海建鑫化学试剂厂);无水乙醚、三乙胺(TEA)和N，N-二甲基甲酰胺(DMF，分子筛干燥后减压蒸馏)(AR，国药集团化学试剂有限公司);磷酸缓冲液(PBS)(pH=7.4);肝癌细胞株BEL-7404和正常肝细胞株L-02购自中国科学院上海细胞库.端氨基聚(醚-酰胺)共聚物配体(Ⅱ)的合1.2成取端氨基聚乙二醇(Ⅰ)(1g，0.2985mmol)于单口瓶中，磁力搅拌使其溶于干燥DMF.再取DTPAA(0.0714g，0.2mmol)加热溶于3mLDMF，滴加.加入三乙胺84μL(0.6mmol)，室温反应24h，减压蒸出DMF，无水乙醇重结晶3次，真空干燥得白色粉末产物Ⅱ1.01g，产率94.2%.含有荧光探针的肝癌靶向肽/聚(醚-酰胺)1.3FAM-13/PEG/DTPA共聚物Ⅲ的合成在5mL单口瓶中加入Ⅱ(36mg，6.912μmolNH2)，MBS(2.16mg，6.912μmol)，TEA(0.4μL)，干燥DMF(2mL)，磁力搅拌下室温反应3h，减压实验试剂及配制二亚乙基三胺五乙酸二酐(DTPAA);端氨基1.12009-08-11收稿，2009-10-12修稿;国家高科技研究发展计划(863计划，项目号2004AA302080)、上海市闵行区域“三区联动”项目*(项目、上海市科委重点项目(项目和上海市磁共振重点实验室(华东师范大学)开放课题基金资助;通讯联系人，E-mail:cmsong@chem.ecnu.edu.cn宋春梅等:具有荧光探针的靶向肽/聚(醚-酰胺)制备及其肝癌细胞靶向性能研究8937期蒸出DMF.然后加入FAM-13肝肽(12mg，7.4088μmol)，PBS(9mL，pH=7.4)，磁力搅拌下室温反应24h，透析72h(透析袋截留分子量是3400)，每隔8h换透析液1次，至透析外液无颜色，透析内液为带有黄绿色荧光的产物水溶液，冻干后得淡黄色粉末产物33.8mgⅢ，合成过程见示意图1.率为500.13MHz，谱宽10.0kHz，32.77K数据点，重复周期为3.00s，累加32次