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SHED培养基本试剂、仪器 高糖型DMEM 培养基 胎牛血清 Ⅰ型胶原酶 dispase 酶 胰酶1：250 抗波形蛋白多克隆抗体（Vimentin） 高倍双抗液 不完全培养液 完全培养液 磷酸盐缓冲液 鼠抗人波形蛋白多克隆抗体 鼠抗人STRO-1多克隆抗体 鼠抗人CD44多克隆抗体 即用型SABC 免疫组化染色试剂盒 培养皿，培养瓶 70μm 细胞筛网 倒置相差显微镜及照相系统 CO2 培养箱 圆筒式过滤器 血细胞计数板 电热恒温水槽 低温高速离心机 SHED培养基本步骤 1. 经患者及家属同意后，收集6～10岁儿童临床上因滞留而拔除的乳切牙，要求没有牙体牙髓病变。拔除后立即置入4°C 预冷的装有少量不完全培养基的试管中备用，在24 小时内取出使用。 2. 从预冷的培养液中取出牙齿,高倍双抗液反复冲洗,无菌条件下沿牙齿长轴劈开牙冠,取出冠根部牙髓,无菌PBS 反复冲洗，切除根尖部1ｍｍ的牙髓组织。剪碎牙髓组织,置于无菌小锥形瓶中。 3. 3mg/ml collagenase typeⅠ、4mg/ml dispase按1：1混合，牙髓碎片放入混合液中，37℃水浴，消化15min。 4. 待组织块呈絮状加入完全生长液终止消化，300×g离心力离心5 min，弃去上清液。 5. 将组织团块均匀铺入3．5 cm的培养皿中，在各组织块处分别滴加50—1 00 UL完全生长液，置入37℃、体积分数5％C02培养箱中孵育，两三天更换完全生长液。 6. 待组织周边有较多的细胞爬出后，挑弃组织块，补足完全生长液继续孵育。 7. 当大多数克隆的细胞汇合至80％一90％时，吸弃原来的培养液，加入0.25%胰酶溶液，使细胞充分浸润，一般消化时间1-3min,肉眼观察瓶底由半透明转为点状透明时弃去胰液，并加入适量有血清培养液终止消化，吹打分散、传代。 有限稀释法纯化SHED 取对数生长期的第一代乳牙牙髓细胞，用含20% 胎牛血清的高糖DMEM 培养基倍比稀释，调整细胞密度至10～15 个/mL，充分吹打混匀。 按100μL/孔接种于96 孔板中，培养24h 后标记单个细胞孔，并补液至200μL/孔，4d 换液。 3. 当细胞数量增多时每2～3d 换液，待长满孔底后0.25%胰蛋白酶消化，扩大培养。 磁珠分离筛选SHED 取生长状态良好的第3代乳牙牙髓细胞1×108以含1%胎牛血清的PBS重悬，加STRO-1抗体，4℃孵育60min,每隔10min轻振．防止细胞沉淀。 用含有0.1%胎牛血清的PBS清洗三次，去除残留抗体。 细胞再次重悬通过30μm的滤网获得单细胞悬液，按说明加入相应剂量的磁珠混匀，4℃孵育1 5min，加人10ml缓冲被以300 g离心力离心10min，完全去除上清。 加入500μm缓冲液混匀细胞团。 将分选柱置磁力架上．用500μm缓冲液预先润湿分选柱，缓冲液快要滴完时将细胞悬液加选到分选柱内不要产生气泡，待细胞悬液快要滴完时加人500μm缓冲液重复3次，收集从分选柱流出的SHED。 从分选器上取下分选柱加入1ml缓冲液，用分选柱配套的推子快速推下，将收集到的SHED再次经过分选柱重复筛选一次。 加入含15%胎牛血清的完全培养液4ml置37℃、5%C02培养箱中培养。 SHED的鉴定 细胞克隆形成率（CFU）的测定 A. 取纯化的第2 代人乳牙牙髓干细胞以1×105个/孔的密度接种6 孔板,加培养液2.5mL，标准条件下培养约14ｄ。 B．镜下观察培养皿中出现细胞克隆,终止培养,加纯甲醇固定15min,适量姬姆萨染液染色15min,流水缓慢冲净,空气干燥。 C. 显微镜下进行细胞克隆计数(≥50 个细胞为1 个细胞克隆). 克隆形成率=形成细胞集落数/接种细胞数(1×105)。 免疫组化染色 A. 将纯化的第2代细胞以3×104/mL接种于预置小盖玻片的24孔培养板中，置 37°C、5% CO2温箱中培养2d. B. 细胞铺满后，取出小盖玻片置于PBS漂洗三次，每次5分钟。 C. 放入预冷的95%丙酮20分钟，取出后PBS漂洗三次，每次5分钟。 D. 浸入0.75%H2O2-PBS（30%H2O25ml+PBS200ml），于室温放置20分钟， 以去除内源性过氧化物酶。PBS漂洗三次，每次5分钟。 E. 滴加正常马血清（10%血清-PBS），置湿盒内于37°C暖箱内30分钟。 F. 弃去正常马血清。抗波形蛋白多克隆抗体免疫组化染色﹑抗STRO-1多克隆抗体免疫组化染色﹑免疫荧光染色。 G. 空白对照组加PBS代替一抗。 流式细胞仪分选细胞 收集磁珠分选后状态良好的细胞，消化后制备成细胞密度为1×106/ml的细胞悬液。 分别以荧光索标记的抗CD29mAb—PE，抗CD34mAb-PE，抗CD45mAb-FITC，抗CDl05mAb