植物组织培养的原理、技术及其应用.doc

植物组织培养的原理、技术及其应用 植物组织培养(plant tissue culture)是指在无菌条件下，将外植体(植物器官、组织、花药、花粉、体细胞甚至原生质体)接种到人工配制的培养基上培育成植株的技术。由于外植体只是植物体的一小部分，因而可以研究其在不受植物体其他部分干扰的条件下的生长和分化规律；另一方面，人们可以通过改变外植体的培养条件(如培养基的配方、光照和培养温度等)去人为地影响它们的生长和分化，这对研究器官、组织和细胞的生长、分化、发育规律以及解决植物形态建成中的一些理论问题都很有帮助。另外，植物组织培养技术在农学、园艺、林业、医药等生产实践上也得到了广泛应用。 9.3.1 植物组织培养的原理 前已述，植物细胞具有全能性。植物组织培养技术正是利用植物细胞全能性以及细胞极性和再生特性，将其从植物体中分离出来并给予一定的培养条件，使这些已分化的细胞脱分化，然后在一定的条件下再分化，最后形成完整的植株。因此，组织培养中有细胞的脱分化和再分化过程。所谓脱分化(dedifferentiation)，是指已经分化的植物器官、组织或细胞在离体培养时，又恢复细胞分裂的能力，并形成与原有状态不同细胞的过程。新形成的细胞群被称为愈伤组织(callus)，即具有分生能力的细胞群。再分化(redifferentiation)是指脱分化形成的愈伤组织细胞在适宜的培养条件下，又分化为胚状体(embryoid)，或直接分化出根和芽等器官形成完整植株的过程。所谓胚状体是指由体细胞衍生而来的类似于胚胎结构的细胞或细胞群。胚状体具有根、茎两个极性结构，因此可以一次性形成完整的植株(图9-6)。 图9-6 植物组织培养的过程 9.3.2 植物组织培养的技术条件 植物组织培养的技术条件主要包括培养基的配制、无菌条件和培养条件等。 9.3.2.1 培养基的配制 植物组织培养中一个关键的步骤是培养基的配制。不同的外植体、不同的培养方法、不同的培养目的等，都要求采用不同的培养基。目前，在植物组织培养上常用的培养基有十几种，这些培养基的配方虽有所不同，但其主要成分是相同的。 首先，培养基中含有大量的水分，可以满足外植体生长对水分的需要。 其次，培养基中的矿质元素包括植物必需的大量矿质元素N、P、K、Ca、Mg、S和微量元素Fe、Mn、B、Cu、Zn、Mo、Cl以及非必需的Na等。碳源一般采用蔗糖(质量浓度30～50g·L-1)，有些培养基也采用葡萄糖。糖除了给外植体提供碳源外，还可调节培养基的渗透势。 植物生长调节物质的种类，则要根据培养的目的适当选用。生长素类可采用IAA、IBA、2，4-D和NAA等，细胞分裂素类常使用KT、6-BA、ZT等。在诱导根和芽的分化时，还需根据要求调整培养基中CTK/IAA的比值。 维生素中，B1(硫胺素)是必需的，而烟酸、B6(吡哆醇)和肌醇(环己六醇)虽不是必需的，但对生长有促进作用，所以一般也添加到培养基中。 有些培养基中还包括氨基酸(如甘氨酸)、水解酪蛋白、酵母汁、椰子乳等有机附加物，以促进细胞的分化。 根据培养基的物理状态，可将植物组织培养分为固体培养和液体培养。所谓固体培养，是在培养基中加入固化剂，使培养基呈固体状态。所采用的固化剂多为琼脂，最适浓度一般为0.6%～1%(重量/体积)。液体培养是在培养基中不加入固化剂，培养基为液体状态。为了保证液体培养时的氧气供应，可在液体培养基上架设纸桥或进行振荡培养。 生长在自然界的植物体对土壤的pH值有一定的要求，外植体培养时也不例外。因此，最后还要将培养基的pH值调节到适当的水平。 对组织培养的外植体生长而言，培养基的组成成分是一个决定性的因素，不同的植物材料要求不同的培养基，适于诱导愈伤组织的培养基不一定适于器官分化，适于固体培养的培养基不一定适于液体培养，因此要想获得成功，必须精心选择适宜的培养基。一般常用的培养基有下列几种：MS培养基(Murashige和Skoog，1962)、米勒培养剂(Mil1er，1963)，H培养基(Bourgin和Nitsch，1967)、改良怀特培养基(White，1963)、N6培养剂(朱至清等，1974)。 9.3.2.2 无菌条件 由于培养基的营养十分丰富，微生物极易滋生而造成污染，因此，在植物组织培养的整个过程中都必须保持严格的无菌条件。 外植体(explant)的消毒通常采用氯化汞、过氧化氢、次氯酸钙、次氯酸钠或70%的酒精等，消毒后需用无菌水充分冲洗。 培养基及接种用的用具必须进行高温高压(在消毒锅中)灭菌。接种时须在超净工作台上进行，操作人员的手也必须经常用70%的酒精擦拭、消毒。 培养室要尽量保持无菌状态，定期用紫外灯照射和用杀菌剂熏蒸杀菌。 9.3.2.3 培养条件 生长在自然界中的植物体所需的光、温、水、气等条件，也是植