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丙酮酸激酶测定试剂盒使用说明 分光光度法 货号: BC0540 规格: 50 管/48 样 产品内容： 提取液：60mL×1 瓶，4℃保存； 试剂一：液体 45 mL×1 瓶，4℃保存； 试剂二：粉剂×1 支，-20℃保存； 试剂三：粉剂×1 支，-20℃保存；临用前每支加入 1.5mL 双蒸水充分溶解备用，用不完的 试剂仍 4℃保存一周； 试剂四：液体×1 支，4℃保存； 临用前每支加入 900µL 双蒸水充分溶解备用， 用不完 的试剂仍 4℃保存一周。 产品说明 ： PK （EC 0）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，催化糖酵解过程中的最 后一步反应，是糖酵解过程中的主要限速酶之一，也是产生 ATP 的关键酶之一，因此测定 PK 活性具有重要意义。 PK 催化磷酸烯醇式丙酮酸和 ADP 生成 ATP 和丙酮酸，乳酸脱氢酶进一步催化 NADH 和丙 酮酸生成乳酸和 NAD + ，在 340nm 下测定 NADH 下降速率，即可反映 PK 活性。 需自备的仪器和用品 ： 紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL 石英比色皿、研钵、冰和蒸馏 水。 操作步骤： 一、 样本的前处理 1、细菌或培养细胞： 先收集细菌或细胞到离心管内， 离心后弃上清； 按照细菌或细胞数量 （104 个） ： 提 取液体积 （mL）为 500-1000：1 的比例 （建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液） ， 超声波破碎细菌或细胞 （冰浴，功率 20％或者 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次） ； 8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 2、组织： 按照组织质量 （g） ：提取液体积 （mL）为 1:5-10 的比例 （建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液） ，进行冰浴匀浆；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 3、血清 （浆）样品：直接检测。 二、测定步骤及加样表： 1. 分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。 2. 工作液的配置：临用前将试剂二转移至试剂一中，充分溶解待用；现配现用。 3. 将工作液、试剂三置于 37℃ （哺乳动物）或 25℃ （其他物种）预热 10 分钟。 4. 加样表： 试剂名称 （µL） 测定管 工作液 900 试剂三 30 试剂四 15 样本 30 将上述试剂按顺序加入 1mL 石英比色皿中，立即混匀，加样本的同时开始计时，在 340nm 波长下记录 20 秒时的初始吸光度 A1，比色后迅速将比色皿连同反应液一起放入 37℃（哺 乳动物）或25℃ （其它物种）水浴中准确反应 2 分钟；迅速取出比色皿并擦干，340nm 下 比色，记录 2 分 20秒时的吸光度 A2，计算 ΔA A1-A2。 PK活力单位的计算： 1、 血清 （浆）PK 活力的计算: 单位的定义：每毫升血清 （浆）在反应体系中每分钟消耗 1nmolNADH 定义为一个酶活力单 位。 PK （U/mL） △ [A×V 反总÷ （ε×d）×10 9 ] ÷V 样÷T 2613 △ ×A 2、 组织、细菌或细胞中 PK 活力的计算: （1） 按样本蛋白浓度计算： 单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1nmolNADH 定义为一个酶活力单位。 PK （U/mgprot）＝ △ [A×V 反总÷ （ε×d）×109] ÷(Cpr×V 样)÷T 2613 △ ×A ÷Cpr （2） 按样本鲜重计算 单位的定义：每 g 组织每分钟消耗 1nmolNADH 定义为一个酶活力单位。 PK （U/g 鲜重）＝ △ [A×V 反总÷ （ε×d）×109] ÷(W×V 样÷V 样总)÷T