家蚕论文：家蚕W染色体特异转基因品系的建立及ZFN打靶初探.docVIP

家蚕论文：家蚕W染色体特异转基因品系的建立及ZFN打靶初探 【中文摘要】昆虫不育技术(Sterile Insect Technique, SIT)是一种无污染并且物种特异的害虫控制方法,是害虫大面积综合治理(Area Wide-Integrated Pest Control, AW-IPM)的重要组成部分。这一技术的广泛运用可以明显减少人们对有机杀虫剂在控制害虫中的依赖,更好的保护生态环境。遗传区性品系(genetic sexing strains)是昆虫不育技术中的重要课题,在害虫防治中,单一释放不育雄虫要比双性释放效率高,这主要是因为释放不育害虫之间更倾向于同型交配,影响控制靶标害虫的效率；而且,许多害虫的雌虫起着主要的危害作用,双性释放会导致一些不必要的危害。更高效率地分离雌雄,有助于提高SIT项效率。家蚕是重要的经济昆虫,也是鳞翅主要模式物种,在家蚕中发展遗传区性品系有助于提升蚕丝产业经济效益,对鳞翅目害虫SIT项目也有参考价值。相对于雌蚕,雄蚕易养且不易患蚕病,食取的桑叶量少；雄蚕的吐丝量高,高出雌蚕约20%；雄蚕吐丝的品质也明显优于雌蚕。专养雄蚕一直是蚕桑生产者追求的目标。前苏联,日本和中国的研究者均进行过一些有益的探索,其中,前苏联科学家Strunnikov通过传统的辐射生物学及染色体易位技术培育出的性连锁平衡致死品系最有实用价值,目前国内推广的雄蚕品种均是在该理论框架基础上改造的。但Strunnikov的方法需要找到合适的标记基因以及长期大量的筛选工作,很难在不同的物种间推广,成本很高。Marec等人提出了一种通过转基因技术,实现鳞翅目遗传区性品系的策略,在针对苹果小卷蛾SIT项目中,一个条件致死基因插入到W染色体上,给予一定条件,雌性死亡,释放的雄性(性染色体为ZZ型)为不含转基因的个体,在不影响不育雄性竞争力的同时避免了转基因会对生态环境产生危害的担忧。但鳞翅目转基因技术的基础均为随机插入,目前为止,仍然没有W染色体转基因插入的文献报道。锌指核酸酶(ZFNs)由识别特异DNA序列的锌指结构域和非特异性的核酸内切酶FokI两部分组成。特异设计的ZFN可以介导靶DNA序列的双链断裂(DSB),利用细胞自身的DNA修复机制(非同源末端连接NHEJ或同源重组修复HDR)引入基因突变,基因修饰或基因添加,从而实现对生物体遗传信息的定向改变。ZFNs已经在多个物种和细胞中成功进行了基因敲除或定点基因添加,随着锌指核酸酶技术的发展,利用该技术在家蚕中实现定点转基因似乎变得可行。但对于家蚕来说,ZFN是否能够实现高效率基因打靶还需进一步的实验证据。本研究调查了家蚕160个转基因系,统计转基因阳性的性别比例,以期找到插入到W染色体上的转基因系,再通过分子生物学方法,证明这一转基因系；设计了GFP靶向的ZFN,以家蚕转基因系pBac(该转基因系茧壳发红色荧光,复眼表达绿色荧光蛋白)为打靶对象,体外合成GFP-ZFN的RNA,通过胚胎显微注射该mRNA,探索GFP-ZFNmRNA对转基因家蚕GFP基因的打靶效率。主要结果如下：1.W染色体转基因家蚕的获得在本实验中,我们调查了家蚕160个转基因系,在对转基因系的荧光分析中发现,编号为158和159的转基因系存在一定的性别荧光比例。我们对这两组转基因系与野生品系进行了杂交或自交处理,158转基因系的后代没有出现性别和荧光比例的差异,159转基因系的后代中,雌性个性全部为EGFP阳性个体,雄性个体部分为EGFP阳性,我们推测该转基因系含有两个转基因插入拷贝,一个在常染色体上,另一个在性染色体上,进一步对该转基因系与野生品系进行杂交分离,得到编号为30-13的转基因品系,后代中雌性全为转基因阳性,雄性全为转基因阴性。根据孟德尔遗传定律推测,30-13转基因品系的为W染色体转基因品系。2.W染色体转基因家蚕的分子检测我们首先提取了30-13雌性与30-13雄性的基因组,根据EGFP序列设计了引物,以野生雌雄蚕的基因组作为对照组,通过PCR检测,初步证明了30-13转基因品系为W染色体插入。为了确定30-13转基因品系的拷贝数,我们对该品系做了Southern blot检测,运用了两组内切酶(Xbal和Bglll)对30-13转基因品系的雌雄蚕基因组进行酶切,实验结果显示,30-13转基因品系为单拷贝插入,反向PCR结果显示该转基因的插入位点位于W染色体上。3. GFP-ZFN的mRNA打靶效率的初探本实验选取家蚕转基因系pBac为基因打靶实验品种,我们设计了GFP靶向的锌指核酸酶,锌指核酸酶核酸序列由公司合成,得到合成序列后,构建了GFP-ZFN的mRNA表达载体,通过试剂盒,体外合成了GFP-ZFN的mRNA,对GO期实验品种进行胚胎注射,观测了GO代的表型并做了统计,之后观查了G1