免疫血清制备，分离.pptVIP

二.离子交换层析法 原理 利用不同的蛋白质在缓冲溶液中所带电荷不同，与某一载体上的具有相反电荷的离子基团进行吸附，然后进行解脱，达到纯化蛋白质目的。 载 体 + + + + + + + - - - - - - - 载体一般选用二乙氨乙基纤维素（diethylaminoethyl cellulose, DEAE),用酸处理后带正电荷，与蛋白质吸附，然后用硷性溶液洗脱，Ig 的pI=7.3~8.2(约7.7左右）。其他蛋白质pI低，继续吸附。 - 三. 凝胶过滤法 原理： 凝胶是网状结构，当分子大小不同的混合物通过凝胶柱时，分子大的先下来，分子小的后下来，将分子大小不同的物质分离开来，即为分子筛的作用。 * * 免 疫 血 清 制 备 第一节 概 述 一.免疫血清：即抗血清、抗体 二.制备免疫血清的意义：作为试剂（特异性、敏感 性）、开展新项目、科研 三.免疫血清分类：多价（针对多价抗原）、单价（如 抗人IgG）、单克隆 四.制备抗体方法：两大种 免疫动物法 制备单克隆抗体方法：杂交瘤技术 基因工程技术 第二节 抗原的制备 抗原制备的目的：分离提纯 一.抗原的制备 （一）颗粒性抗原的制备： 1.细胞：以绵羊红细胞（sheep red blood cell, SRBC)为例,Alsever保存液保存的羊血，生理盐水洗3次，配成2%细胞悬液，勿溶血！ 2.细菌：抗原性完整 纯培养 隔水煮沸杀死 配成109/ml （二）可溶性抗原：蛋白质类、酶、补体、细菌外毒素等 1.提取：破碎、消化----离心（根据抗原性质） 2.纯化：生化技术: 离心（根据分子大小）、沉淀（盐析）、柱层析（亲和、凝胶、离子交换） （三）免疫球蛋白片段 酶裂解法：木瓜蛋白酶、胃蛋白酶 （四）核酸：用氯仿－异丙醇抽提法---去杂蛋白 （五）半抗原：激素、多肽、多糖、类脂质、核苷、药物等 1.半抗原必须与载体结合（牛白蛋白） 2.抗原提纯、鉴定（纯度、含量）方法根据 性质选择，联合使用 3.可溶性抗原必须加佐剂 二.佐剂（adjuvant） （一)概念：同抗原一起或预先注入机体，可增强抗原免疫应答或改变应答类型的物质 （二)分类：微生物及产物、无机化合物、人工合成大分子物质（双链多聚肌、腺苷酸）、油剂（福氏不完全、完全佐剂） （三)作用机理：延长抗原刺激、刺激炎症细胞（浆、淋巴、吞噬）、引起局部肉芽肿、促进细胞接触、处理抗原 （四）福氏佐剂的配制 （四）福氏佐剂的配制 福氏不完全佐剂（FA）组成： 羊毛脂 石蜡油 福氏完全佐剂（CFA）组成： 羊毛脂 石蜡油 BCG 加佐剂抗原配制方法： 最后成为油包水状 第三节 动物的准备及免疫 一.动物的选择及准备 1.选择：种类与抗原、需量、青壮年、无感染 只数：至少2只（避免个体差异）。蛋白质抗原一般：家兔、山羊等。（IgE---绵羊、胰岛素---家兔、酶---山羊） 2.观察、喂养：建立卡片、免疫前测相关抗体 二. .免疫程序：先应有方案（来源于资料） （一）免疫剂量：不同抗原用量不同，蛋白质为例：大动物0.5~1mg/只/次/天，小动物0.1~0.6mg/只/次/天（抗原量过小、大均不好） （二）免疫时间：首次与第2次10~20天，一般3~5次，不同抗原次数不同，效果不好可追加1~2次；半抗原间隔时间长40~50天，可持续一年左右。每次免疫后均应记录，并观察反应。 （三）途径：重要，含佐剂抗原不能静脉、腹腔注射 常用途径：皮下、皮内多点（背部）、淋巴结内、帼窝淋巴节周围、颌下、耳后等。一般一次可选用1~2种。 皮内容易引起细胞免疫，对产生抗体好，淋巴结内抗原需量少（10~100μg），先刺激使其肿大 第四节免疫血清采集及保存 一.测试效价 不同抗血清测试方法不同 颗粒性抗原—凝集试验 可溶性抗原—沉淀试验 血细胞—溶血试验 效价不好应追加免疫，最多2次 二.采血、分离血清 （一）采血：根据情况一次性、多次性，注 意无菌 （二）分离血清：无菌，灭活56℃ 30分 （三）免疫血清鉴定及浓缩： 1.抗体特异性鉴定 用相近抗原试验，有交