植物原位杂交.docVIP

植物RNA 原位杂 一、制片 1. 材料的固定和包埋 固定液：FAA: 10%甲醛，5%冰醋酸， 50%乙醇（均为RNase-free, DEPC Day 1: 取植物材料，茎剥层FAA，抽真 空15min，缓换4℃过 Day 2: 脱 50%乙醇30min 50%乙醇60min 60%乙醇60min 70%乙醇60min 组织块可在70%乙醇中4℃保存达个 Day 3: 85%乙醇60min 95%乙醇60min 100%乙醇30min 100%乙醇30min 100%乙醇60min 25%二甲苯+75%乙醇60min 以下有二甲苯，在通风橱 50%二甲苯+50%乙醇60min 75%二甲苯+25%乙醇60min 100%二甲苯60min 100%二甲苯60min 100%二甲苯60min 组织两100%二甲苯，第二次至组织为 50%二甲苯+50%石蜡58℃过 Day 4: 换两100%石蜡（58℃），倾时产 Day 5: 换两100%石蜡（58℃），倾时产 Day 6: 换两100%石蜡（58℃），倾时产 用干净较纸纸纸双层 包埋。 2. 杂针备 1 将转录DNA(通常50-300bp，无polyA )克隆在PGEM T-easy vector 上，摇 提质样测连T7 或者SP6 引物测连 即是用T7 或是SP6 转录酶转录sense 探针T7 引物的测结 连则T7 转录针antisense,才是正确探针 2） 用T7，SP6 引物从质将扩来积扩200-400ul）。若产 干净则净胶RNase-free 的管子，NFW 水溶解（30-40ul, 浓200ng/ul） 3） 用回收产转录 T7: DNA 300-500ng 10×T7 buffer 1ul 10×labeling mix 1ul Inhibitor 0.5ul 37℃ 1hr T7 polymerase 1ul DTT 1ul NFW 补10ul SP6: DNA 300-500ng 10×SP6 buffer 1ul 10×labeling mix 1ul Inhibitor 0.5ul 40℃ 1hr Sp6 polymerase 1ul 1%BSA 1ul NFW 补10ul DNase 消化: 转录产10ul 10×buffer 6ul 37℃ 15min DNase I 3ul NFW 补60ul 沉淀： 消化产60ul 4M LiCl 7.5ul 0.2M EDTA(可灭酶) 7.5ul 100%乙醇 225ul /总积300ul -80℃ 过4℃，12000rpm, 20min 去上清 75%乙醇洗，4℃， 7500rpm 5min 同上，再洗一次 冰上开盖 30ul NFW 溶解，沉淀前、后分别1-2ul 电 4） 探针Tube RNA(ul) From tube RNA Dilution Buffer(ul) Dilution Final concentration 1 1 Original - - 10ng/ul(假定） 2 1 Original 9 1:10 1ng/ul 3 5 2 45 1:100 0.1ng/ul 4 15 3 135 1:1000 0.01ng/ul 5 15 4 135 1:10000 0.001ng/ul 1 将针对1ul 点Nylon membrane 上 2 UV-cross linker(2400) 3 将2ml 冻 4 2ml Washing buffer 2min 5 2ml Blocking solution 30min 6 2ml Antibody solution 30min 7 2ml Washing buffer 15min 8 2ml Washing buffer 15min 9 2ml Detection buffer 2-5min 10 2ml Detection buffer+20ulNBT/BCIP（2:1） 锡纸冻5min 看一次 探针试剂 试剂