Western blot 操作规程.doc

附录2：Western blot 操作规程 （一）细胞裂解及蛋白样品的定量处理 1、将培养的细胞经预冷的PBS漂洗2次后，用细胞刮刮取贴壁细胞，离心后弃上清。 2、加入适量裂解液（具体体积视所检测的目标蛋白而定），于冰上反复吹打2 min（切忌将气泡带入离心管中）。（细胞必须种的均匀一些，所以种细胞的时候需要用枪加，而且必须是充分混匀之后，这样才能保证实验结果的准确信的） 3、吹打完毕，将裂解产物全部转移至预冷的微量离心管中，置于冰上，每5min振荡一次，共孵育30 min，以使其充分裂解。 4、4 oC离心12,000 g，离心时间为15 min。 5、每管各取10 μl上清液，进行蛋白定量（每个样品重复2孔 ）。 6、将各管上清液全部转移至新预冷的微量离心管中，记录各管的裂解总体积；以蛋白浓度最低的管为标准，用裂解液将其余各管调整至与该管相同的浓度；将各管样品与5×上样缓冲液混合后，于沸水中煮10 min，即为蛋白样本；最终的样品于-80 oC保存。 （二）组织裂解操作方法 1、用灭菌的预冷的工具分离目的组织，尽量置于冰上以防蛋白酶水解。 2、将组织块放在圆底的微量离心管或Eppendorf管中，加入液氮冻结组织于冰上均质研磨。 3、每约5 mg加入约300 μl 预冷的裂解液，冰浴匀浆后置于4 oC摇动2小时，裂解液体积与组织样本量有适当比例，（最终的蛋白浓度至少达到0.1 mg/ml, 理想的蛋白浓度应为1-5 mg/ml)。 4、4 oC离心12,000 rpm，20 min，轻轻吸取上清，转移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀。 （三）Western blot 操作规程 1、封闭胶槽。灌胶之前，先用胶条封闭胶槽底部，再用5 ml注射器将0.5%琼脂糖沿胶槽边沿快速（避免琼脂糖凝固）注入封闭胶槽。 2、配胶。浓缩胶的配制方案详见表1，分离胶的浓度选择详见表2，分离胶的配制方案详见表3。配胶时最后加TEMED。(促凝的试剂，冬天的时候凝的很慢，可以动作慢一下。夏天的时候加了TEMED之后很快就凝固了，所以就需要动作快一些) 表1. 浓缩胶配制方案 组分名称 4 ml 5 ml 6 ml 8 ml 9 ml 10 ml H2O 2.7 3.4 4.1 5.5 6.1 6.8 30% A/B 0.67 0.83 1.00 1.34 1.51 1.68 1.0MTris-HCL(PH6.8) 0.50 0.63 0.75 1.00 1.13 1.25 10%SDS 0.04 0.05 0.06 0.08 0.09 0.10 10%AP 0.04 0.05 0.06 0.08 0.09 0.10 TEMED 0.004 0.005 0.006 0.008 0.09 0.01 表2. 分离胶的浓度选择 表3. 分离胶的配制方案 3、分离胶的灌制。用注射器沿倒胶槽边缘迅速注入分离胶，每块胶按5ml配制即可。分离胶灌制完毕，于其上加入1 ml去离子水，以防止胶面氧化。为使电泳槽两侧胶面的电泳速度一致，两侧胶槽内的分离胶及水的体积应保持一致。 3、浓缩胶的灌制。待分离胶凝固后（约50 min），倒去胶面上层水，用滤纸吸干。沿胶槽边缘迅速注入浓缩胶，每块胶按4 ml配制即可。然后，将梳子沿水平方向轻轻插入，防止气泡进入胶层。 4、蛋白样品准备。取出蛋白样品，于沸水中煮10 min。煮好后瞬时离心，并置于37 oC水浴箱中备用。 5、1×电泳缓冲液配制。去离子水400 ml，5×SDS电泳缓冲液100 ml。 6、将浓缩胶放入电泳槽中（若只电泳一块胶，则胶槽另一侧需垫一块玻璃板），将电泳液缓慢注入电泳槽，槽内电泳液需漫过内侧的玻板，外侧需漫过金属线。加液完毕，轻轻拔掉胶条。 7. 预电泳。在每块胶上任选择一电泳孔，加入20 μl左右上样缓冲液，在80 V电压下进行电泳，直至上样缓冲液全部从分离胶中分离并进入电泳液中。 8、上样。待浓缩胶凝固后上样（约30 min）。按照各管样品的总体积，算出其实际上样量（理论上样体积为30 μl），加样前先用200 μl加样器将样品轻轻混匀，上样速度要慢，否则样品易溢出加样孔。每加一个样品，进样针需用去离子水反复冲洗数次，再用电泳缓冲液润洗数次，以免交叉污染。蛋白Marker的上样量为4 μl（不足30 μl时，以1×上样缓冲液补足）。上样完毕，在加样孔的两侧分别注入30 μl1×上样缓冲液，以防止边缘效应。进样针用完后，先用去离子水清洗数次，再用甲醇反复冲洗，最后用去离子水清洗晾干后保存。 9、电泳。电泳采用恒压模式，先选择80 V电压，待上样缓冲液运动至浓缩胶与分离胶分界线处时，将电压调整至100 V。待胶条中蛋白Marker的各条带彻底分离时，即可终止电泳。