脲酶的分离纯化及比活性测定.pptVIP

1. Protein concentration assay Total protein： Kjedahl nitrogen assay/凯氏定氮法 Lowry method/Folin-酚法 BCA Assay Biuret assay/双缩脲法 UV absorption/紫外吸收法 Specific protein content: Activity assay, western blot 蛋白浓度、纯度及活性测定 2. purity Electrophoresis: single band HPLC: single peak Solubility analysis crystallization 3.Activity analysis 4. Storage of protein keeping purified protein in 50% glycerol,? or? 1% serum albumin? at -70? -80o C? or liquid nitrogen if needed Store in small portions , avoid repeated freeze-thaw. Protein Purification Disrupt Blender, homoginizer Remove debris Centrifugation Precipitate/concentrate Ammonium sulfate Purify Chromatography Quality Analysis: Activity, purity, concentration Storage * * 脲酶的分离纯化及比活性测定 制备脲酶粗提液 装柱 凝胶过滤层析 蛋白质含量检测 蛋白质活性检测 脲酶活性测定原理 CO(NH2)2 + H2O 2NH3 + CO2 脲酶 NH4OH + 2(HgI2·2KI) + 3NaOH O NH2I + 4KI + 3NaI + 3H2O Hg Hg 硫代双汞氨（黄色） 奈氏试剂 反应1 反应2 脲酶活性高 生成氨就多 黄色亦深 制备脲酶粗提液 称0.5克黄豆粉于小三角瓶中 加2.5ml32%丙酮，震荡10min 离心3000转，10分钟 上清液转至新离心管，加4倍体积冷丙酮 离心3000转，5分钟 沉淀，待丙酮挥发后，加1.2ml蒸馏水溶解 上清/粗提液 2×1.5ml EP 管, 10000转,5分钟 转移至1.5ml EP 管, 10000转,5分钟 离心3000转，10分钟 凝胶过滤层析 装柱：保持竖直，防分层、干裂 平衡：装好后用蒸馏水平衡 加样：加0.6ml粗提液 洗脱与收集：用蒸馏水洗脱，3ml/15分钟/管，收集12管 蛋白质含量检测：A280测定 粗提液稀释20倍再测，测完A280，务必保留样品 蛋白浓度（mg/ml）=A280?0.75 酶活性检测 蛋白含量测定 空白 洗脱液 粗提液 (1:20稀释) 1 2 3 … 9 10 11 12 A280 [蛋白](mg/ml) 1.硫酸铵标准曲线制作 管号 试剂 1 2 3 4 5 6 7 0.001M硫酸铵(ml) 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 - 含NH3的μmol数 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 - H2O（ml) 2.9 2.8 2.7 2.6 2.5 2.4 3 混匀 奈氏试剂 0.75ml, 混匀，测A480 A480 脲酶活性检测-1 硫酸铵标准曲线制作 含NH3的μmol数 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 A480 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 NH3的μmol数 = A480 ? K 脲酶活性检测-2 空白 洗脱液 粗提液 (1:20稀释) 1 2 3 … 9 10 11 12 3%尿素(ml) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.1M PBS 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 37度保温15分钟 酶液 -- 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 H2O 0.5 -- -- -- -- -- -- -- -- -- 混匀，37度保温15分钟 向各管加入1M HCl 0.5ml,放置5分钟，加1M NaOH 0.5ml终止反应 2. 酶促反应 脲酶活性检测-3 空白 洗脱液 粗提液 (1:20稀释) 1 2 3 … 9 10 11 12 上述反应液 0.5 0.05~0.5 0.05~0.1