RealTime_RT-PCR实验流程.doc

RealTime RT-PCR实验流程μl氯仿，振荡混匀； （4）离心：4℃，12000rpm，15min； μl异丙醇，轻轻混匀，室温静置15min； （6）离心：4℃，12000rpm，15min；4℃，rpm，5min；μl DEPC H2O，65℃ 5min助溶； （11）-20℃冷冻保存。 Total RNA质量检测 （1）NanoDrop测定Total RNA浓度（2μl Total RNA上样） （2）1.5%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量 Total RNA 500ng 5× Loading Buffer 2μl DEPC H2O to 7~8μl 65℃变性5min，冰浴5min EB（500倍稀释） 1μl 总体积约为8~9μl 甲醛变性琼脂糖凝胶：30ml 1×TBE Buffer中加入0.45g琼脂糖，微波炉中加热溶化，轻轻摇动使琼脂糖充分混匀（肉眼观察无颗粒状悬浮物），冷却至60℃左右时加入600μl甲醛，混匀，倒入RNA专用的制胶器中（7.5×5.5cm）30min左右即可使用。 电泳条件：120~130V，15~20min。 DNaseⅠ消化基因组DNAμg RQ1 RNase-Free DNase 10× Reaction Buffer 5μl RQ1 RNase-Free DNase 2μl（5U/μl） RNase Inhibitor 1μl（40U/μl） DEPC H2O to 50μl 37℃消化30min。 Total RNA纯化 （1）补RNase-Free H2O使消化纯化后Total RNA溶液总体积为100μl； （2）在RNA结合柱收集管中加入300μl RA1； （3）将100μlTotal RNA溶液移至RNA结合柱收集管中，和300μl RA1充分混匀； （4）加入300μl无水乙醇，充分混匀，并将上述混合液移至RNA结合柱中； （5）离心：室温，1000rpm，；μl RA3； （7）离心：室温，1000rpm，；μl RA3； （9）离心：室温，1000rpm，；μl RNase-Free H2O至结合柱硅胶膜上； （11）离心：室温，1000rpm，℃冷冻保存。 Total RNA纯化效果验证 （1）NanoDrop测定纯化后Total RNA浓度（2μl纯化后Total RNA上样） （2）1.5%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测Total RNA纯化效果 纯化后Total RNA 500ng 5× Loading Buffer 2μl DEPC H2O to 7~8μl 65℃变性5min，冰浴5min EB（500倍稀释） 1μl 总体积约为8~9μl 甲醛变性琼脂糖凝胶配置方法及电泳条件均同上述Total RNA质量检测时。 Total RNA消化效果验证 用纯化后的Total RNA作为模板对看家基因进行PCR反应，需做阴性对照（不加模板）和阳性对照（已知的cDNA）。 （1）PCR反应体系 Template（纯化后Total RNA） 1μl（0.3-0.5?g） 10×Buffer 2.5?l dNTPs 0.5μl（10mM/?l） Primer Forward 0.5μl（10?M/?l） Reverse 0.5μl（10?M/?l） r-taq 0.5μl（10U/?l） Nuclease-Free H2O to 25μl （2）PCR程序 95℃ 3min，95℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 30s，72℃ 10min，4℃，共进行35个循环。μl 2× Loading Buffer 4μl 总体积约为6~8μl 非变性琼脂糖凝胶：80ml 1×TBE Buffer中加入1.2g琼脂糖，微波炉中加热溶化，轻轻摇动使琼脂糖充分混匀（肉眼观察无颗粒状悬浮物），冷却至60℃左右时加入2μl EB（原液）混匀，倒入制胶器中（15×15cm），室温静置30min左右即可使用。 电泳条件：100V，25~30min。 RNA逆转录 - Oligo dT 15法RNA逆转录 （1）逆转录反应体系 Total RNA 2~2.5μg Oligo（dT）15 2μl（500μg/μl） DEPC H2O to 11.5μl 65℃变性5min，冰浴5min 5× 1st Buffer 4?l 0.1M DTT 2?l dNTPs 1?l（10mM/?l） RNase Inhibitor 0.5μl（40U/μl） M-MLV 1μl 共20μl体系 （2）逆转录程序 ①温浴℃ 10min，37℃ 1h，4℃ for ever。 ②加入5μ1.5M NaOH