LAMP和巢式PCR检测克氏原螯虾白斑综合征病毒_WSSV_的比较.doc

周小燕,魏育红,杨　贺,等. LAMP和巢式PCR检测克氏原螯虾白斑综合征病毒(WSSV)的比较[J].江苏农业科学, 2011(1): 27-30. LAMP和巢式PCR检测克氏原螯虾 白斑综合征病毒(WSSV)的比较 周小燕,魏育红,杨　贺,贡成良,薛仁宇,曹广力,朱越雄 (苏州大学基础医学与生命科学学院,江苏苏州215123) 　　摘要:白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)是克氏原螯虾(Procambarus clarkii)养殖生产中危害最大 的病原之一,也是其他一些重要经济虾类的主要病害,但是目前没有相应的有效治疗药物。为了减少WSSV对克氏原 螯虾的危害,及早发现病原,以便采取相应措施将损失降到最小程度,笔者开展了以环介导等温扩增 ( loop-mediated isothermal amplification,LAMP)法检测克氏原螯虾WSSV的研究,并且与灵敏度非常高的巢式PCR检 测法进行了比较。结果表明,用LAMP法可以快速、灵敏、特异性地检测克氏原螯虾WSSV,其灵敏度与巢式PCR相 比,高出约500倍,且不需要专用的PCR仪,是检测WSSV的一种理想方法。该结果也为其他虾类的WSSV检测提供 了重要参考。 　　关键词:LAMP;白斑综合征病毒(WSSV);巢式PCR;克氏原螯虾 　　中图分类号: S945. 4+9　　文献标志码: A　　文章编号: 1002-1302(2011)01-0027-04 收稿日期: 2010-03-23 基金项目:江苏省苏州市攻关项目(编号: SNZ0518)。 作者简介:周小燕(1985—),女,安徽宣城人,硕士,从事水生动物病 原分子生物学研究。E-mai:l zxy2zsm@ yahoo. com. cn。 通信作者:薛仁宇,博士,副教授。Te:l (0512 E-mai:l xuery@ suda. edu. cn。 　　对虾白斑综合征病毒(WSSV)是线头病毒科(Nmi aviri- dae)白斑病毒属(Whispovirus)的唯一成员[1],宿主域广泛,由 它引起的白斑综合征病毒病曾肆虐全球,并给全球虾类养殖 业造成巨大的经济损失[2-3]。据美国亚利桑那大学估计,白 斑综合征病毒给世界对虾养殖业造成的损失每年在40亿~ 80亿美元之间,现已被世界动物卫生组织(OIE)列为必报疾 病之一[4]。从2004年开始,我国学者陆续在养殖的克氏原螯 虾(Procambarus clarkii)体内发现了WSSV[5-6]。2007年5 月,美国国家兽医局实验室(NVSL)也报道了在路易斯安那 州的养殖和天然克氏原螯虾中检测到WSSV[7]的消息。为了 深入研究WSSV,陈昌福等对克氏原螯虾进行了人工感染的 研究,结果证明克氏原螯虾对WSSV非常敏感[6]。近年来,克 氏原螯虾的养殖规模日益扩大,主要虾产区均有发生白斑综 合征的报道[8],这说明白斑综合征病毒病已经成为严重威胁 克氏原螯虾生产的主要传染性疾病。由于没有相应的治疗药 物,一旦发病极易形成暴发态势,造成重大经济损失。至今为 止,国内外学者普遍认为只有综合预防才是目前唯一可以采 取的措施[9],而其中最为重要的措施就是建立快速、方便而 又灵敏的WSSV诊断方法。 目前对WSSV的诊断方法主要包括病理学观察、流式细 胞术方法、免疫学方法、生物学方法以及PCR方法等[10-13]。 其中PCR检测主要包括一步PCR、二温式PCR、荧光定量 PCR和巢式PCR等[10,14-15],当前常用的WSSV检测方法是一 步PCR和巢式PCR。但是一步PCR的灵敏度较低,经常会出 现漏检的情况;巢式PCR虽然灵敏性较高,但比较费时,两者 均需要专用的PCR仪。2004年,Kono等首次使用了一种新 的LAMP法(loop-mediated isothermalamplification)即环介导 等温扩增法通过扩增WSSV基因组(GenBank登录号: AF369029)的相应区域检测WSSV[16]。此法一经推出,便很 快在水产动物病原快速检测中得到充分应用[17]。在10年间 已有250多篇关于LAMP的文章发表,表明其用途非常广 泛[18]。有研究报道利用PCR扩增WSSV的ORF 234可实现 对WSSV的诊断[19]。本研究根据WSSV的ORF 131(Gen- Bank登录号:EF524223)序列设计了一组LAMP引物,并根据 WSSV的ORF 234(GenBank登录号:AF332093)[20]序列设计 了巢式PCR引物,首先对用LAMP法检测WSSV的反应进行 了优化,并在此基础上比较了LAMP和巢式PCR检测WSSV 的灵敏度。 1　材料