GUS活性的定量检测.docx

GUS活性的定量检测目的：定量检测转基因植株中报告基因GUS的表达水平用途：比较某个启动子在不同组织中的表达强度，比较不同启动子在同一组织中的表达强度。试剂： 磷酸缓冲液母液： 0.2M Na2HPO4：71.64g/L Na2HPO4·12H2O0.2M NaH2PO4：31.21g/L NaH2PO4·2H2OGUS抽提液（1L）：PH=7.0 0.2M Na2HPO4 152.5mL 0.2M NaH2PO4 97.5mL 14.3M β-ME 700uL Na2-EDTA·2H2O 3.72g Triton-X 100 1mL10mM 4-MUG（10×）： 105.6mg 4-MUG溶于30mL GUS抽提液中，4℃避光保存。（注意：存放时间越久本底信号越强，尽量现配现用）。0.2M Na2CO3反应终止液（1L）：21.2g Na2CO3溶于1000mL ddH2O。BSA母液（4ug/ul）：40mgBSA溶于10mL ddH2O4-MU母液（10mM）：17.6mg 4-MU溶于10mL 0.2M Na2CO3中，4℃避光保存。Protein Assay Buffer（5×，Bio-Rad cat.no.500-0006）：使用前要用ddH2O稀释成1×工作液仪器及用品：酶标仪TECAN Infinite M200酶标板（Nunclon 96 Flat Transparent和Greiner 96 Flat Black）操作步骤与注意事项：材料于液氮中研磨成粉末，取适量粉末加入3倍体积的GUS抽提液，充分混匀，置冰上。（注意，尽量保证每个样品所取的粉末量都比较一致，这样抽提出来的总蛋白浓度比较接近，方便后续操作。）10000g 4℃离心10min，上清液转移到新的1.5mL离心管，则得到总蛋白粗提液（可于4度短期保存或于-70℃长期保存；但不要存于-20℃，该温度下GUS不稳定）。总蛋白浓度测定（Bradford法）：先取BSA标准品（4ug/ul），用ddH2O稀释8个梯度，浓度分别为2000ng/ul、1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625 ng/ul。方法：取8个管子，各加50uL ddH2O，取50uL 4ug/ul的BSA母液加入第一个管子，吸打混匀之后从中再取出50uL加入第二个管子，依此类推。（注意，稀释时至少取50uL进行操作，取少了不准确，浓度偏差会比较大，影响标准曲线的制作。稀释后可在4℃短期保存。）将各个样品的总蛋白抽提液、空白对照（GUS抽提液）以及8个BSA标准品各取2uL加入到透明酶标板（Nunclon 96 Flat Transparent）中，加入198uL 1×Protein Assay Buffer，在5-20min时间内测定595nm的吸光值。（注意，放置超过20min会产生沉淀。）TECAN Infinite M200程序设置：（开机、关机顺序请见酶标仪上面的说明书）打开Magellan软件，点击将弹出放酶标板的座子，将酶标板放上去之后再点一下则把酶标板送入酶标仪。（注意：不是用手推的！放酶标板的时候要记住自己加样的位置，有没有盖盖子）选择creat/edit a method，点击，选择new则可新建一个方法。首先选择酶标板型号Nunclon 96 Flat Transparent，如果盖了盖子就在plate with cover前打勾；其次选择样品所在的位置，黄色表示该孔加了样品，仪器只检测黄色区域。继续选择测量方法，从左侧选项中找到Absorbance，鼠标左键选中，拖拽到中间松开左键则建立吸光度测定方法，再在出现的选项框中选择合适的参数：测定595nm，还可根据需要选择内参（reference），每个孔测定次数与位置（multiple reads per well和Number of flashes）等。再点击，在出现的界面中填写空白对照（）、标准品（）和样品（）的位置。（填清楚了一是防止遗忘，二还可以通过软件自动计算出样品浓度；也可以全部选，后期自己用excel计算，依各人习惯。）继续点击，保存方法，若选择则在保存后马上开始测量。测量结束后，选择edit-copy to excel则可将结果导出到excel中。点击，保存结果，最后点击，取出酶标板。以标准品的浓度为横坐标，相应的OD595为纵坐标作散点图，添加线性趋势线，显示公式和R2值，将各样品的OD595值代入公式中的y，算出x则为各样品的总蛋白浓度。GUS活性的测定：取10-100ug总蛋白（具体用量要先做个预实验确定，注意叶绿素含量过高会影响检测），加入1mL含有1mM 4-MUG的GUS抽提液中（反应液应提前预热），于37℃反应，在第5min，15min，25