western blot 实验操作流程.docVIP

一、相关溶液的配制 30%聚丙烯酰胺： 丙稀酰胺 29 g N，N-亚甲基双丙稀酰胺 1 g 加入去离子水溶解定容至100 ml 避光、室温贮存于棕色瓶中。 5%过硫酸胺： 0.15 g过硫酸铵溶于1 ml去离子水中，现用现配。 浓缩胶缓冲液： Tris碱 6.05 g SDS 0.4 g 去离子水溶解，调PH值到6.8，定容至100 ml 分离胶缓冲液： Tris碱 36.3 g SDS 0.8 g 去离子水溶解，调PH值到8.8，定容至100 ml 浓缩胶配方： 30% 丙烯酰胺 2.04 ml 浓缩胶缓冲液 0.625 ml 1.5% 过硫酸胺 0.25 ml TEMED 10 (l 加水补至 5 ml 分离胶配方： 30% 丙烯酰胺 0.4 ml 分离胶缓冲液 0.625 ml 1.5% 过硫酸胺 0.125 ml TEMED 10 (l 加水补至 2.5 ml 2×SDS凝胶上样缓冲液： Tris碱 0.6 g DTT 1.54 g SDS 2 g 溴酚蓝 0.1 g 甘油 10 ml 加去离子水定容至50 ml 5×SDS凝胶电泳缓冲液： Tris碱 15.1 g 甘氨酸 94 g SDS 5 g 加去离子水定容至1000 ml 甲醇/醋酸脱色液： 甲醇 450 ml 冰醋酸 100 ml 水 450 ml 考马斯亮蓝染液： 考马斯亮蓝G250 0.25 g 甲醇/醋酸脱色液 100 ml 滤纸过滤 聚丙烯酰胺凝胶固定液： 甲醇 50% 冰醋酸 10% 水 40% 聚丙烯酰胺凝胶干燥液： 冰醋酸 7.5% 甲醇 40% 甘油 10% 电转缓冲液： 甘氨酸 2.9 g Tris碱 5.8 g SDS 0.37 g 甲醇 200 ml 加去离子水定容至1000 ml TBS： Tris碱 1.21 g NaCl 4 g 去离子水溶解，浓盐酸调pH值至7.5，定容至500 ml TBST：Tween20 0.5 ml TBS 1000 ml 封闭液： 脱脂奶粉 5 g TBS 100 ml 二、操作流程 SDS 装板，配制分离胶，加入TEMED后，立即注入玻璃板间隙，并为浓缩胶留足间隙，用枪头吸水，水封。聚合后(约15 min)，倒掉覆盖的水，配制浓缩胶，混匀后注入玻璃板间隙，插入梳子，避免混入气泡，垂直放置10 min. 浓缩胶聚合的同时，样品和加样缓冲液混匀煮样95℃，6 min 在浓缩胶聚合后，用滤纸整理梳孔，将凝胶放入电泳槽中，并用缓冲液冲洗梳孔。上下槽倒入1×电泳缓冲液 按次序上样，注意加入蛋白Marker. 电泳：开始时用100V电压，染料进入分离胶后，增加到200V，电泳染料到达分离胶底部切断电源。 切胶，染色脱色或Western blot分析 2转膜： 带手套，剪两张滤纸和1张PVDF膜，大小和凝胶完全吻合，不能大于凝胶，并在左上角做标记 将PVDF膜浸入100%的甲醇10 sec，浸入去离子水5 min;浸入电转液10 min 将滤纸和多孔垫片浸入电转液 安装转膜装置： 从＋(红色) ( (黑色)依次为：多孔垫片(滤纸( PVDF膜(凝胶(滤纸(多孔垫片 接通电源：恒流 电流选择：2×PVDF面积2 hrs （半干转）从＋ ( -极（盖）依次为滤纸(PVDF膜(凝胶( 滤纸接通电源：恒3. Western blot 取膜，放入10 ml封闭液中，室温轻摇2 hr或4℃过夜 10 ml TBST轻摇洗膜5 min×1次 将抗体以适当稀释度加入10 ml抗体封闭液中，室温轻摇1 hr，或4℃过夜。 20 ml TBST轻摇洗膜5 min×3次 将膜放入10 ml抗体稀释液(含适量稀释的二抗)中，室温轻摇30 min 20 ml TBST 轻摇洗膜8 min×4次 4 ECL显色 配制显色液：1 ml A液＋1 ml B液混合 将膜浸入显色液中，室温5 min 取出膜，用滤纸吸去多余的液体 用新鲜的保鲜膜把PVDF膜包起来 X光片暗盒中曝光，5 min 放入显影液中5 min，至显出条带，放入定影液中2 min，水冲洗，室温干燥