技术方法名称 RT-PCR.docVIP

技术方法名称 基本原理 总RNA或poly(A)+ RNA随机引物、oligo(dT)或基因特异性的引物（GSP）RNA杂交，然后由RNA依赖的DNA聚合酶催化合成互补的cDNA拷贝，后者能进一步用于PCR扩增。RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。在两步法RT-PCR中，每一步都在最佳条件下进行。cDNA的合成首先在逆转录缓冲液中进行，然后取出1/10的反应产物进行PCR。在一步法RT-PCR中，逆转录和PCR在同时为逆转录和PCR优化的条件下，在一只管中顺次进行。两步法RT-PCR比较常见，在使用一个样品检测多个mRNA时比较有用。然而一步法RT-PCR具有其他优点。一步法RT-PCR在处理大量样品时易于操作，有助于减少残余污染，因为在cDNA合成和扩增之间不需要打开管盖。一步法可以得到更高的灵敏度，最低可以达到0.1pg总RNA，这是因为整个cDNA样品都被扩增。对于成功的一步法RT-PCR，一般使用反义的基因特异性引物起始cDNA合成。 一步法步骤 起始第一链cDNA合成使用： 起始第一链合成使用 Oligo(dT) GSP引物 随机六聚体 ? GSP引物 ? 优点 优点 ?灵活 ?方便 ?引物选择 ?扩增酶同逆转录酶预先混合 ?扩增酶的选择 ?转管步骤少，减少污染可能性 ?困难RT-PCR的优化能力 ?高灵敏度 ?同Platinum?酶结合提高特异性 ?适用于大量样品分析 ?同Platinum Pfx Taq DNA聚合酶结合提高忠实性 ?适用于定量PCR ?适用于在单个样品中检测几个mRNA ? 关于扩增酶和产物大小应注意： ?对于小于4kb的产物使用Taq DNA聚合酶或Platinum Taq DNA聚合酶 ?对于小于12kb的产物使用Platinum Pfx Taq DNA聚合酶或Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity ?对于大于12kb的产物使用ELONGAE? Enzyme Mix ?对于一步法RT-PCR，如果产物小于3.5kb，使用Taq DNA聚合酶或Platinum Taq DNA聚合酶；如果产物小于9kb，使用Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity。 用途 RT-PCR将以RNA为模板的cDNA合成同PCR结合在一起，提供了一种分析基因表达的快速灵敏的方法。RT-PCR用于对表达信息进行检测或定量。另外，这项技术还可以用来检测基因表达差异或不必构建cDNA文库克隆cDNA。RT-PCR比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原位杂交及S1核酸酶分析在内的RNA分析技术，更灵敏，更易于操作。从RNA水平对基因的表达进行检测或定量’、3’末端序列和从非常少量的mRNA样品构建大容量的cDNA文库方面都是极其灵敏与通用的方法。此外，RT-PCR还易于鉴定已转录序列是否发生突变及呈现多态性。 RT-PCR是以RNA为模板，前提是基因有转录。然而，许多基因的转录表达具有组织特异性。而且，许多基因的丰度很低，不易检测。所以这些都使得RT-PCR的应用受到一定的限制。 实验材料 1. 耗材 离心管（规格：0.5 ml）、Tip（规格：0.2 ml）。 要求 无RNase和DNase污染。 处理方法 一般来说，未开封的进口离心管或Tip均无RNase和DNase污染。但为了慎重起见，需要重新处理。处理程序如下：洗涤饭盒、烧杯和量筒，使之干净 干烤，250℃ 4h，或180℃ 8h以上。干烤时，量筒和烧杯口均需要用铝箔纸 量筒量取无菌去离子水（最好是新鲜制备的水），在烧杯中配制含0.1%DEPC的水溶液，配制时要求混匀，因为DEPC难溶于水 DEPC水溶液加到干烤过的饭盒中，一般需要1.2L，投入适量的离心管和Tip，并尽量使它们均浸泡在水溶液中 37℃过夜 尽可能地倒去浸泡液，注意不要开盖，以避免RNase的污染 高压蒸气灭菌，15 lbf/in2,（1.034×105Pa），20min 烘干，100℃ 2h 置于干净的环境，备用 2. 试剂 逆转录酶 Taq酶及其缓冲液 基因特异性引物 Oligo(dT)12-18，或随机引物，或基因特异性引物（GSP） 10mM dNTP Mix 逆转录缓冲液 0.1M DTT RNase抑制剂 无菌去离子水 所有与逆转录有关的试剂均要求无DNase和RNase污染。基因特异性引物一般由博亚、生工等国内公司合成，PAGE纯化，并用无DNase和RNase的无菌去离子水溶解。Oligo(dT)12-18或随机引物、dNTP Mix、逆