H9亚型鸭源禽流感病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR快速检测方法的建立.pdf

福建农业学报 25(4)：387～391，2010 FujianJournalofAgriculturalSciences 文章编号 ：1008—0384 (2O10)04—387—05 H9亚型鸭源禽流感病毒 SYBRGreen工实时荧光定量 RT～PCR快速检测方法的建立 万春和 ，林 避 ，施少华 ，林秋敏 ，陈红梅 ，程龙飞，傅光华 ，林 芳，林建生 ，黄 瑜 (福建省农业科学院畜牧兽医研究所 ，福建 福州 350013) 摘 要 ：针对 H9亚型禽流感 HA基 因保守序列设计 引物 ，建立基于 SYBRGreenI检测模式的荧光定 量 RT—PCR (real—timeRT—PCR，RRT—PCR)，最低检测 限为 8．33×10拷 贝质粒 DNA，与常规 PCR相 比，灵 敏度高出 100倍。扩增产物的熔解 曲线分析只出现 1个单特异峰，无引物二聚体，Tm值为 (83．83+-0．22)℃， 组 内变异系数为 0．52 ～1．48 ，组间变异系数为 0．71 ～2．21 ，可重复性好 ；对 H5亚型禽流感病毒、鸭 肝炎病毒、鸭瘟病毒、鸭源禽 1型副粘病毒无扩增 ；检测速度快，从样本处理到报告结果仅需 4．5h。 关键词：H9亚型禽流感病毒 ；SYBRGreenI；实时荧光定量 PCR (RRT—PCR) 中图分类 号：S855．3 文献标识码 ：A SYBR Green工RT—PCR forrapiddiagnosisofH9SubtypeAvianInfluenzaVirus W AN Chun-he，LIN Su，SHIShao—hua，IAN Qiu—rain，CHEN Hong—mei，CHENG Long—fei，FU Guang—hua， IINFang，LINJian—sheng，HUANGYu (1．InstituteofHusbandryandVeterinaryMedicine，FujianAcademyoJAgriculturalSciences． Fuzhou，Fujian 350013，China) Abstract：A pairofspecificprimerstargetinghemagglutiningeneofH9avian influenzavirus(AIV)wasdesigned forthedevelopmentofaSYBR Green Ifluorescentbased real—timeRT —PCR (RRT —PCR)tOquantifytheH9 subtypeAIV forrapiddiagnosis．ThedetectionlimitofRRT —PCR was8．33×10 plasmidcopies．Themelting curveanalysisusingSYBR GreenIdyeshowedonespecificpeak atthemelting temperatureof(83．83±0．22)℃ withnoprimer-dimerspeak．Noamplificationwasdetectedbythismethodfrom theunrelatedRNA samples，such asH5subtypeAIV，duckhepatitisvirus，duckplaguevirusoravianparamyxovirustype一1．Highreproducibility wasobtainedfordetectingplasmidDNAwithintra—assayof0．52 一1．48V0andinter—assayof0．71 一2．21 ． Keywords：H9subtypeavian influenzavirus；SYBR Green I；RRT —PCR H9N2亚型禽流感病毒 (avianinfluenzavirus， 源 ，是典型的禽源流感病毒。 AIV)最早于 1966年 由 Hommee等_l从火鸡体 内 目前 ，H9N2亚