DNA的生物合成和修复.pptVIP

第三章 DNA的生物合成和修复 3.2 DNA的复制 酵母的复制起始点 称为ARS，有100多个bp，包括一个共有序列（A）和附加元件（B1-B3）。A元件中有富含AT的11bp序列是复制起始识别复合物（ORC）结合复制起始位点所必需的，对起始因子在复制起始位点的组装起基本作用。 3.2 DNA的复制 真核生物DNA复制的过程 解链 合成引物并延长 引物酶与pola偶联，合成引 物和iDNA。 pold取代pola合成前导链 pole取代pola合成滞后链 PCNA：滑动钳 RFC：滑动钳组装器 RFA：真核单链结合蛋白 DNA解旋酶 3.2 DNA的复制 DNA在核小体内解链形成复制子，复制后核小体立即在两条子链上迅速形成，组蛋白经历了重新装配。 3.2 DNA的复制 真核生物DNA复制的终止 线性DNA上有多个复制眼，复制叉的推进使复制眼增大，直至各个复制眼融合复制终止，形成两个线状DNA分子。 RNA引物最终被降解，可能导致线状DNA 5’端不断变短，信息丢失。 端粒 3.2 DNA的复制 端粒 维持染色体的完整 性和稳定性 解决末端复制问题 位于真核生物染色体DNA的3’末端，由独特的DNA重复序列及相关蛋白组成的复合体。 由简单的不含遗传信息的重复序列组成，富含G；长度达几到几百kb；端粒DNA序列有取向性：富含G的单链为5’?3’延伸，并长于富含C的单链12~16nt；染色体末端与特定蛋白形成复合物。 3.2 DNA的复制 端粒酶 催化端粒合成的酶，由一条RNA和多种蛋白质构成的核糖核蛋白复合体，具有逆转录酶活性，能以其自身携带的RNA为模板逆转录合成端粒DNA。 作用机制：端粒酶的RNA与端粒DNA配对，以RNA为模板进行逆转录合成DNA，向5’→3’延伸端粒至模板RNA末端后，延长的DNA末端与RNA模板解离，端粒酶移动，重新定位于延长后的DNA 3’端，开始下一轮延长过程，如此反复可达数百次合成几百个或数千个重复序列。 引物酶和 DNA聚合酶 3.2 DNA的复制 端粒酶与衰老 端粒长度在体细胞内比在生殖细胞 内短。 大多数体细胞不合成端粒酶，每次 分裂后端粒就变短。 生殖细胞表现端粒酶活性。 当端粒比正常的长度短数kb时细胞 就不再分裂。 端粒缩短是细胞衰老的普遍现象。 癌细胞的端粒酶活性很强，癌细胞 能无限期分裂增生。 3.2 DNA的复制 端粒酶与药物 ——抑制端粒酶活性入手 反义核苷酸或PNA作用于hTERT的mRNA 反义核苷酸或PNA作用于端粒酶RNA模板 核酶作用于端粒酶RNA模板 逆转录酶抑制剂（AZT） 细胞分化诱导剂抑制端粒酶活性 3.2 DNA的复制 DNA复制的其它方式 线粒体DNA复制——D环复制（双链环状） 两条链不同步复制 3.2 DNA的复制 单链环状DNA复制 ——滚环复制 M13噬菌体 3.2 DNA的复制 1. 识别 2. 组装复合物 3. 迁移 4. 引发 5. 延长 f×174噬菌体引发体的形成和引发 3.2 DNA的复制 f×174噬菌体的滚环复制 3.2 DNA的复制 线状DNA复制 T7噬菌体：双链线状，复制从 DNA中间开始 腺病毒：双链线状，复制从DNA 末端开始 微小病毒：单链线状 线性DNA复制时5’隐缩 T7噬菌体：DNA两端的序列区有160bp长的序列完全相同。T7 DNA复制时产生的两个子代DNA的3’-端尾巴以互补结合。再由DNA聚合酶I填充和DNA连接酶连接后，形成2个单位长度的T7 DNA分子。 PCR技术 即聚合酶链式反应，指在引物指导下由酶催化的对特定模板（克隆或基因组DNA）的扩增反应，是模拟体内DNA复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的一种技术。 3.2 DNA的复制 3.2 DNA的复制 PCR反应的基本过程 模板DNA的变性 模板DNA与引物的退火 引物的延伸 PCR反应的五个元素：引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ 循环 PCR反应的特点 强特异性 高灵敏度 快速简便 低纯度模板 点样孔 －＋ 标准分子量 产物条带 琼脂糖凝胶电泳观察PCR反应产物 3.2 DNA的复制 3.3 逆转录 逆转录 依赖RNA的DNA聚合酶 RNA酶H活力 依赖DNA的DNA聚合酶 逆转录酶 5 3 5 引物 5 3 5 3 逆转录酶 逆转录酶 以RNA为模