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影响MTT比色实验的关键环节 比色实验的环节 试剂的准备 细胞培养 试剂的添加 温育 比色 步骤 什么是MTT比色实验 即四唑盐比色试验，是检测细胞存活和生长方法的试验 广泛应用于细胞毒性和细胞增殖情况的检测 任一步操作不当都会影响测定结果 试剂的配置 试剂的配置 MTT试剂配置过程中需注意： 1.配置和操作尽量无菌 2.最好带薄膜手套 3.四度避光冻存，避免反复冻融 4.避免从冰箱中拿出即用 从冰箱中拿出时应注意 实验时将试剂从冰箱拿出来即用 这种做法忽略了有可能因温度低 而影响试验结果. 试剂的准备 细胞培养 试剂的添加 温育 比色 步骤 用100 mL/L胎牛血清培养液将细胞制成1×103~1× 104单细胞悬液,接种于培养板,每孔接种量200μL 需设立对照组 生长良好的单层培养细胞用2. 5 g/L胰蛋白酶消化液充分消化,检测细胞的贴壁率、倍增时间,检测不同接种细胞数条件下的生长曲线 将96孔培养板在37℃, 50 mL/L CO2条件培养3~5 天 倒置显微镜下观察 细胞培养步骤 消化/检测 接种 培养 图片所示80%~90%密度时细胞的大致状态 试剂的准备 细胞培养 试剂的添加 温育 比色 步骤 试剂的添加 培养3－5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS ph=7.4配)20ul. 试剂的添加 加样的准确性 避免产生气泡 加样的速度 加样的角度（使用滴瓶时） 试剂的准备 细胞培养 试剂的添加 温育 比色 步骤 温育 加入MTT液后37℃孵育4 h。 为保证37℃条件下足够的温育时间,实验时应自行确定不同季节不同温度,96孔板内溶液温度达到37℃的时间。 试剂的准备 细胞培养 试剂的添加 温育 比色 步骤 比色 1.呈色后尽量吸净培养孔内残留液，避免将结晶吸除。 2.加入150ul DMOS(二甲基亚砜)使结晶物溶解。 比色 3.在酶联免疫检测仪上测量各孔吸光值 注意： 波长的选定在490 nm MTT 吸光度要在0-0.7之间 总结 综上所述 尽管MTT比色试验测定的操作步骤比较简单 但有可能会影响到测定结果的因素却较多 每一个步骤都需认真对待