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特异性抗原刺激胞内细胞因子检测 ——BD FACS应用 检测方法 流式细胞术(Flow Cytometry) 酶联斑点法（ELISPOT） 原位杂交 免疫组化 单细胞PCR 流式检测胞内细胞因子原理 细胞因子是可溶性蛋白，在淋巴细胞应答中有重要的免疫调节作用。细胞因子可以调节细胞生长、分化以及一系列功能，并且介导正常与病理性免疫应答。 检测单个细胞的多个参数，包括大小、颗粒度、荧光标记抗体检测细胞表面抗原、胞内抗原。 抗细胞因子抗体与细胞表面特定亚群标志组合，即可检测不同细胞亚群细胞因子的分泌。 细胞因子检测的主要临床应用 机体免疫状态的评估 疾病预后及治疗监测指标 病理变化和损伤机理研究 药物/疫苗效果的评估 人Th1/Th2和Tc1/Tc2的检测 Th1 和Th2 细胞均分泌多种细胞因子: Th1 细胞主要分泌IL-2、IL-12、IFN-γ和TNF-β/a等; Th2 细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6 和IL-10 Th1：CD4+IFN-γ+， Th2：CD4+IL-4+ Tc1：CD8+IFN-γ+, Tc2：CD8+IL-4+ 常用细胞因子检测 分离制备细胞 活化细胞 封闭细胞表面Fc受体 细胞表面抗原染色 固定和通透 细胞内细胞因子染色 流式细胞仪测定和结果分析 仪器设备 12×75mm有盖的Falcon管 （BD Catalog No.2058） 37℃孵箱7％CO2 混匀振荡器 离心机 加样器、Tips FACS流式细胞仪 1 单细胞悬液的制备 1.1 全血 使用肝素钠抗凝的VACUTAINER真空采血管（BD VACUTAINER Catalog No.367673）, FastIMMUNE 不易采用肝素锂，EDTA和ACD抗凝剂，血样在8小时内分析，超过8小时会导致活性的损失，一般细胞因子阳性细胞会减少5％。如不能在8小时之内检测，应将真空采血管水平室温放置。 1.2 自身血浆中外周血单个核细胞(PBMCs) 使用肝素钠抗凝的BD VACUTAINER 细胞制备管（CPTs）（BD VACUTAINER Catalog No.362753）24小时内分析。 1.3 组织培养基中的外周血单个核细胞(PBMCs) 用Ficoll分离PBMCs，调节细胞浓度2×106细胞/mL于含10％热灭活胎牛血清（FBS）的RPMI－1640。 1.4 细胞系与T细胞克隆 调节细胞浓度2×106细胞/mL于新鲜培养基中。 1.5 冰冻全血与PBMCs 应用1×FACS溶血素，溶血固定激活全血或PBMCs用PBS漂洗，并用含1％的BSA及10％的DMSO的PBS，冻存－70℃。溶化后细胞置于染色管中，加上2～3mL的洗液，离心5分钟500g，然后用FACS 通透液 通透与染色。 2 细胞的活化 除检测高丰度的和病理情况下表达异常亢进的细胞因子，可取样品细胞直接测定外，一般需要选用适当活化条件，先活化细胞，使之合成欲检测的细胞因子。 Brefeldin(BFA) 阻断胞内高尔基体介导的转运使得细胞因子聚集，蓄积，增强细胞因子信号可被流式细胞仪检测。 活化T细胞：植物血凝素（PHA）、巴豆酯（PMA）、离子霉素（ionomycin）、钙离子载体A23187、T细胞受体抗体、CD3抗体、抗原等。 活化B细胞：脂多糖（LPS）、金黄色葡萄球菌肠内毒素A及B细胞受体抗体、抗原等。 活化单核细胞： LPS等 刺激素协同激活 通常选用的刺激素为PMA(佛波酯)+ Ionomycin(离子霉素)。 其中PMA为PKC(蛋白激酶C)的激活物，PKC 则可激活下游众多的蛋白激酶的磷酸化，形成级联反应，导致许多蛋白的表达，进而引起T 细胞的活化。在细胞内，PKC 可被DAG(二脂酰甘油)和Ca2+的共同作用而激活，因此在Ionomycin(Ca2+的转运剂，可将细胞器内的Ca2+转运至胞浆内)的参与下，T 细胞内PKC 可被进一步激活。可见，PMA 与Ionomycin 协同活化T 细胞。 PMA+inonmycin（PMA+I） 全血或PBMCs用无血清的RPMI1640 1：1稀释（此稀释只适用PMA+I激活，细胞浓度2X106 / mL则无须稀释） 25ng/mL PMA（25μL工作液/mL全血），1μg/mL inonmycin（20μL工作液/mL全血），10μg/mLBFA（20μL工作液/mL全血）共刺激 37 ℃ ，7%CO2 ，4小时孵育（最好用培养箱，松盖，可控制PH值；若用水浴需旋紧盖子。）