RNAi 原理及实验步骤.pptVIP

RNAi：理论与试验操作 激光生命科学研究所 Xi-Chao Wang， December, 2006 目 录 Ⅰ. RNAi 简介 Ⅱ. siRNA 设计 Ⅲ. siRNA 对照 Ⅳ. siRNA 转染 Ⅴ. mRNA 水平RNAi效果监测 Ⅵ. 蛋白质水平RNAi效果监测 Ⅶ. 常见问题解答（FAQ） Ⅰ. RNAi 简介 RNAi的发现： 1990 年,Jorgensen 及Mol 领导的2 个研究小组试图在矮牵牛属植物中通过添加合成色素的基因拷贝,来增加花瓣紫色的着色。结果不但紫色没有加深,却出现白色斑点或全白色。这说明不仅导入的基因未被表达,反而连植物本身的某些合成色素的基因也失活,他们称此现象为共抑制(Co-suppression)。 1995 年康奈尔大学Guo 博士试图阻断秀丽新小杆线虫(C. elegans) 中par21 基因表达,发现给对照实验组线虫注射正义RNA 不但不增加该基因的表达, 反而产生与反义RNA 同样的结果———特异性阻断该基因的表达, 这一与反义RNA 技术传统认知相矛盾的现象一直困绕着人们。 直到1998 年,卡耐基研究院Fire 等发现, 正义RNA 对基因表达的抑制以及过去利用反义RNA 技术对基因表达的阻断,都是由体外转录制备的RNA (包括正义RNA 和反义RNA ) 中污染的微量dsRNA 所引起的。将制备的RNA 高度纯化后发现, 正义RNA 无基因抑制作用, 反义RNA 的基因抑制作用也很微弱,而用纯化后的dsRNA 注射线虫, 却能高效、特异地阻断相应基因的表达, 其抑制基因表达的效率比纯化后的反义RNA 至少高2 个数量级。他们称此现象为RNA 干扰(RNA interference, RNAi) 。随后,RNAi 现象被广泛地发现于真菌、拟南芥、水螅、涡虫、锥虫、斑马鱼等大多数真核生物中。 RNAi：生物技术的蓝月亮 那些能获得诺贝尔奖的科学成就是很难得的,能够创造数十亿美元产值的科学成就更是少见.所以既能获得诺贝尔奖又值几十亿美元的科学成就自然更加珍贵,人们把这种两者兼有的科研成果称为蓝月亮,而这种罕见的蓝月亮在生物技术产业就有两个,而且都出现在20世纪70年代.一种是基因重组技术,利用这种技术将基因植入细胞中可以获得药物,其中最有代表性的药物是治疗贫血的EPO,安进公司因为最先研发出EPO,而成为年产值超过55亿美元的生物产业巨头.另一个蓝月亮的受益者是人类第一个生物技术公司———基因技术公司,这个蓝月亮就是单克隆抗体的发现,单克隆抗体分子能够准确找到病变组织后再将其毁灭.单克隆抗体类药物每年给基因技术公司带来22亿美元的销售额. 或许,生物技术行业盛产蓝月亮.在沉寂了20多年之后,人们又一次在生物技术的地平线上看见了诱人的蓝光,第三个蓝月亮就要诞生了.它就是正在快速发展的RNA干预技术,简称RNAi. A. RNAi实验原理 RNA干扰（RNA interfering，RNAi）现象是由与靶基因序列同源的双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）引发的广泛存在于生物体内的序列特异性基因转录后的沉默过程。细胞中的核糖核酸酶III家族成员之一的，dsRNA特异性的核酸酶Dicer(dsRNA-specific endonuclease, Dicer)将dsRNA裂解成由21-25个核苷酸组成的小干扰RNA (small interfering RNA，siRNA)，随后siRNA作为介导子引起特异性地降解相同序列的mRNA，从而阻断相应基因表达的转录后基因沉默机制。 细胞学知识：RNA聚合酶III转录tRNA、5S RNA和其它小分子RNA 为什么用小RNA进行干扰？ 在哺乳动物细胞中导入外源大分子dsRNA( 30nt) 常常导致非特异性的基因沉默效应,因为它激活了核糖核酸酶RNaseL 而导致非特异性的RNA 降解。相反, siRNA ( 30nt) 不激活RNaseL ,而是通过序列特异性的方式诱导基因沉默效应。该序列特异性方式非常严格,一个碱基的错配会显著降低基因沉默效应。所以siRNA 可解释为一种具有3’两个核苷酸TT突出末端的21～23nt 大小的双链核糖核酸,以RNAi 的中介分子形式特异性诱导目的基因的沉默。 影片：RNAi B. RNAi实验流程 C. RNAi实验实验所需试剂 D. 现在已经商品化的 RNAi 相关产品 Ⅱ. siRNA 设计 A. 哺乳动物siRNA设计 基因抑制的有效性很大程度取决于目的基因序列的选择。目的序列可以随机选择也可以通过在目的基因的不同区域上测试不同的序列以决定何种序列是最有效的。 哺乳动物siRNA设计需要注意的几个方面 1． 从转录本（mRNA）的AU