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细胞内细胞因子染色法 中山医学院免疫学教研室 2009.6 实验原理 细胞因子跨膜分泌阻滞剂BFA，使新产生细胞因子滞留在细胞内； 破膜剂使荧光抗体可以进入细胞内，并可以检测相应细胞因子； 流式细胞记数技术可以记数细胞，分析相应细胞的质和量。 方法特点 1. 单细胞水平计数 2. 简单、快捷、灵敏 3. 实验结果客观 实验过程 取淋巴细胞，刺激剂作用，37℃孵育1小时 加入BFA继续培养5小时，用PBS洗涤。 4%多聚甲醛室温固定8分钟后，PBS洗涤。 重悬细胞， 4℃放置几小时或过夜。 加入荧光标记抗体, 4℃避光30分钟，洗涤。 缓冲液2重悬，流式细胞记数仪检测。 结果分析 需要的缓冲液 1. 1×PBS 1升（洗细胞用） 2. PBS +0.1%BSA+NaN3 0.05% 500ml(用于染色后FACS前) 3. PBS+BSA+NaN3 +0.1%Saponin 250ml(封闭染色后用) 4. PBS +BSA+NaN3+Saponin+5%milk 40ml FCM结构组成部分 液流系统; 将细胞引导至检测位点 光学系统; 产生并收集光学信号 电子系统; 将光信号转换成电信号,使之数字化,输入计算机并分析。 细胞分选系统。 FLOW CELL(流动室) 荧光信号 每种荧光染料均有特定的激发波长, 并激发后会有发射波长,流式细胞仪检测的即是它特定的发射波长. 利用各种不同波长的光学滤片来收集(检测)这些光学信号 荧光染料的特性 激发光源与荧光标记物 电子系统 当细胞携带荧光素标记物, 通过激光照射区时, 受激激发, 产生代表细胞内不同物质、不同波长的荧光信号, 这些信号经A/D转换成数字信号, 送计算机进行储存、 作图、 统计分析 检测器 Photomultiplier tube (PMT) 将光学信号转变为电脉冲(数字数据)信号 标本制备 标本来源:外周血、骨髓、培养细胞、组织(经尼龙网300目过滤) 制成单细胞悬液 标本浓度：106/ml-外周血白细胞计数，白血病人血标本需PBS稀释 抗凝剂：EDTA、肝素-若抗凝不佳，有凝块，则不可检测。 溶血剂：保持细胞形态、红细胞裂解完全。 反应温度：26~27oC，室温避光。 双参数点图 * * 中山大学基础医学院免疫学教研室 流式细胞仪（FLOW CYTOMETER，FCM） 对于处在流动状态的细胞或生物颗粒进行多参数的快速的定量和分析的技术。 检测仪器：流 式 细 胞 记 数 仪 　　 激光技术 电子物理技术 光电测量技术 计算机技术 细胞荧光化学技术 单克隆抗体技术 FCM 是诸多技术的结晶: Injector Tip 荧光信号 聚焦的激光光束 鞘液 激发波长(EXCITING) 发射波长(EMISSION) FALS Sensor Laser 前向角散射光信号 FSC:细胞相对大小和表面积.通常在FACS的应用中,取FSC作阈值,来排除样本中各种碎片和鞘液中的小颗粒.以免对被检测细胞造成干扰. FALS Sensor 90LS Sensor Laser 侧向角散射光信号 SSC:指与激光束正交90度方向的散射光信号,SSC对细胞膜,质膜,核膜的折光率更敏感.可提供细胞内精密结构和颗粒性质的信息 Fluorescence FALS Sensor Fluorescence detector ( FL1,FL2,FL3,FL4) 检测信号