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新的里程碑： TALEN靶向基因敲除 北京康为世纪生物技术有限公司 崭新的技术解决经典的挑战 崭新的技术- TALEN 经典的挑战- 基因敲除 （Knockout） 什么是基因敲除- 通过某种方法将一个特定的目标基 因破坏，使其失去原有的功能。 为什么要做基因敲除- 基因敲除是寻找、证明基因功 能过程中的必要步骤之一。 寻找、证明证明一个基因的功能都需要哪些步骤？ 科研论证基本法则 科霍法则 （Koch‘s postulates ） 如何证明某种微生物导致了某种疾病？ • 该种微生物存在于患病个体而不存在 于健康个体。 • 该种微生物可从患病个体上分离出来 并体外培养。 • 当把该种微生物接种入健康个体体内 Robert Koch 时可使健康个体患病。 1843 – 1910 • 从人为接种的患病个体中又可分离得 到该种微生物。 科研论证基本法则 Falkow的分子科霍法则 （Falkow’s molecular Koch‘s postulates） 如何证明一个基因编码一种毒力因子？ • 该基因存在于毒力菌株，而不存在于无毒菌株。 • 当该基因被敲除时菌株毒力消失或下降。 • 当该基因被补回 （敲除）突变菌株时毒力得到恢 复。 Reverse genetics 为什么要做基因敲除？ • 基因敲除是证明基因功能 不可缺少的逻辑环节 • 基因敲除是基因工程和基 因治疗的重要手段 怎样做基因敲除？ • 经典方法 ：自杀质粒，同源重组– 几率低(~1 HR event per 106 cells ），难 ！ • 革命性的进步：RNAi – 临时性，不完全敲除 – Knockdown • 饱含希望与失望的技术：ZFN • 新的里程碑：TALEN TALEN技术 基于TALEN (transcription activator-like (TAL) effector nucleases)的靶向 基因敲除技术是一种崭新的分子生物学工具，现已应用于细胞、酵母、 斑马鱼与大鼠等各类研究对象。 技术原理： 表达一个重组核酸酶，在靶点识别结构域的作用下，识别靶点核酸序列， 核酸酶发挥内切酶活性，打断目标基因，完成基因敲除的过程。 TALEN 发展过程 • 1989年 植物病原体黄单胞菌属 （Xanthomonas spp. ） avrBs3 基因被克隆。 • 2007年 发现其序列特异性核酸结合特性， avrBs3 – TA • 2009年 Xanthomonas TA氨基酸序列与核酸靶序列的对应关系被破译 • 由34个aa重复序列组成一个单元，重复17 -18次 • 34个aa中的第12和13个氨基酸 （Repeat Variant Di-residue, RVD) 对应识别一个目标碱基 TALEN 发展过程 TALEN 的最前沿 2011年8月， Nature Biotechnology 上同时发表了用TALEN 技术 进行基因敲除的4篇研究文章，另加一篇综述。 • 一篇人类干细胞 《Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases》 • 一篇大鼠 《Knockout rats generated by embryo microinjection of TAL