要旨集-日本农芸化学会中四国支部.pdfVIP

特 　 　 別 　 　 講 　 　 演 講 　 　 演 　 　 要 　 　 旨 特別講演 マイナーな研究から：大腸菌のプログラム死と長期定常期 山田 守（山口大院・創科） 大腸菌は，栄養豊富な至適培養条件下で，誘導期，対数増殖期，定常期，死滅期，長期定常 期を示す。四半世紀前の研究室立ち上げ時に，未知の研究領域にチャレンジしようと，大腸菌 の定常期以降の生存機構を研究テーマとした。当時，シグマ S が定常期のプロモーター認識と 転写開始に係る主要な因子であると認識され始めていたので，まず，プロモーター・ライブラ リーを作製し，シグマS に依存して転写されるものではなく，逆にシグマ S によって発現が抑 制される遺伝子を探索し，５つの遺伝子 ssn （subject to RpoS-dependent negative regulation in stationary phase）を見出した。その内，ssnA は死滅期のCFU （colony forming unit）に影響する 遺伝子で，破壊によって CFU が増大し，高発現によって細胞分裂が抑えられ増殖が強く抑制さ れた。そこで，この抑制を解除するサプレッサー変異を miniTn10 処理によって獲得した。その サプレッサーは，アンチシグマ E ヘの Tn10 挿入変異であった。シグマ E はアンチシグマ E の 結合によって不活性型に維持されているが，この株では Tn10 挿入によって恒常的に活性型とな り，シグマE レギュロンの発現が亢進していた。また，CFU は親株と変わらないが，培養液濁 度が定常期に親株より大きく減少していた。この濁度の減少は溶菌によるもので，コロニー形 成ができない細胞が特異的に破壊され，内容物が培地中に出ていることが確認された。その溶 菌は定常期で顕著であった。シグマ E が関与することから遺伝子発現を伴うプログラム死とし て，そのカスケード解析をすすめたが，かなり遠回りをしてやっと，外膜蛋白質 Omp をターゲ ットとする，シグマE レギュロンのsmall RNA （micA，rybB 等）が関与することを見出した。 Omp のフォールディング・シャペロンであるPpiD の発現抑制も同時に起こり，２重に OmpA， OmpC，OmpW などの生成を抑制し，これによって外膜が不安定となり溶菌に至ると推測され た。親株でもシグマ E 依存性の溶菌が定常期で観察された。その誘因シグナルを探索したとこ ろ，対数増殖期後期から定常期初期にかけて細胞内酸化ストレスが急増し，これによって発生 する異常タンパク質がシグマ E を活性型に変え，シグマE 依存性の溶菌カスケードを発動する と推測された。以上の研究によって，シグマE 依存性の溶菌カスケードを明らかにすると同時 に，対数増殖期後半に酸化ストレスが蓄積すること，高温ストレスシグマとして発見されたシ グマE が対数増殖期後半に発動し，異常な細胞を溶菌によって細胞集団から排除すること，定 常期の溶菌のほとんどはシグマ E 依存性であることが分かった。また，死滅期は一般的に細胞 が死ぬものと考えられているが，CFU を積極的に減少させている現象かもしれない。 長期定常期は数年間続くことが示されており，その期間において，細胞集団の中で発生した 生育優位性（GASP）細胞が次の細胞集団を形成する，すなわち，細胞集団のダイナミックな変 遷が繰り返されると予想されている。ところが，シグマ E 依存性溶菌に係る small RNA の破壊 株では長期定常期は初期に CFU が激減し，破綻することが分かった。また，破綻の直前に変異 率が急増した。これらの結果から，シグマ E 依存性溶菌は，異常細胞の排除や次の細胞集団へ の栄養源供給等によって長期定常期形成に重要な役割を担っていることが推測された。続いて， 長期定常期の細胞集団変遷の解析に次世代シークエンスが有効であることを示し，その解析に おいて新規な GASP 変異を見出した。さらに，現在，細胞集団の変遷を可視化することを試み ている。長期定常期における細胞集団の無数の変遷がどのような変異の累積によって達成され ているか不明である。その究明のために，可視化と迅速な変異