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第六章高效液相色谱分析法 一、高效液相色谱法的特点及基本原理 Characteristic and basic principle of LC 二、液相色谱的固定相与流动相 stationary phase and mobile phase of HPLC 三、分离类型选择 choice of separating types 概 述 以高压液体为流动相的液相色谱分析法称高效液相色谱法(HPLC)，是20 世纪60 年代末发展起来的一项新颖快速的分离分析色谱技术。它是在经典的液体柱色谱法的基础上，采用高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，引入气相色谱理论后发展起来的。其基本方法是用高压泵将具有一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂泵入装有填充剂的色谱 柱，经进样阀注入的样品被流动相带入色谱柱内进行分离后依次进入检测器，由记录仪、积分仪或数据处理系统记录色谱信号或进行数据处理而得到分析结果。HPLC 几乎在所有学科领域都有广泛应用，可以用于绝大多数物质成分的分离分析，它和气相色谱都是应用最广泛的仪器分析技术。 一、高效液相色谱法的特点及基本原理Characteristic and basic principle of LC （一）特点： 高选择性－能同时分离性质极为相似的混合物 高效能－在较短的时间内能同时分离极为复杂的混合物，一般一次色谱分析时间为几分钟到几十分钟，有些快速分析一秒钟可分析7个组分。 高灵敏度－使用高灵敏度检测器可检测10-11~10-13g 的物质，色谱不仅可以作常量分析，也可以作微量和痕量分析。 高压 高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。 如氨基酸、蛋白质、生物碱、核酸、甾体、维生素、抗生素等。 液相色谱法最大的特点是可以分离不可挥发或受热后不稳定的有机物，而且比气相色谱流动相的选择余地大。由于HPLC 的具有色谱柱可以反复使用，流动相可选择范围宽，流出组分容易收集，分离效率高，分析速度快，灵敏度高，操作自动化，适用范围广(样品不需气化，只需制成溶液即可)，定量分析方法的准确度高的特点，在《中国药典》中该法已成为中药制剂含量测定最常用的分析方法。它与气相色谱法配合使用，几乎可以承担绝大部分的有机物分离测试任务。不足之处是定性能力较差。 液相色谱几个名称 高速液相色谱 (High Speed Liquid Chromatography) 高效率液相色谱 (High Efficiency Liquid Chromatography) 高压液相色谱 (High Pressure Liquid Chromatography) 高效(能)液相色谱 (High Performance Liquid Chromatography) （二）GC与LC的区别 高效液相色谱组成 相关名词 色 谱 峰：色谱柱流出组分通过检测器系统时所产生的响应信号的微分曲线。 峰 高：从峰的最大值到峰底的距离。 峰 宽：在峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点之间的距离。 半 峰 宽：通过峰高的中点作平行于峰底的直线，此直线与峰两侧相交两点之间的距离。 脱尾峰：后沿较前沿平缓的不对称峰。前伸峰：前沿较后沿平缓的不对称峰。 鬼 峰：并非样品所产生的峰。 基 线：在正常操作条件下，仅有流动相通过检测器时所产生的响应信号曲线。 基线漂移：基线随时间定向的缓慢的变化。 基线噪音：由各种因素引起的基线波动。 谱带扩张：由于纵向扩散、传质阻力等因素的影响，使组分在色谱柱内移动过程中谱带宽度增加的现象。 峰 容 量：在给定的色谱条件下（柱系统，柱温，流动相线速度），在一定时间内最多能从色谱柱流出满足分离度要求的等高度色谱峰个数。 固 定 相：色谱柱内的填充物。相对流动相而言，固定相在分析中是静止的。 流 动 相：又称溶剂或洗脱液。与此相应的被分离的物质称之为溶质或洗脱物。 正相色谱：与流动相的极性，固定相极性比流动相大。 反相色谱：流动相极性大于固定相。 梯度洗脱：流动相的组成在整个分析过程中随时间变化而变化。 （三）主要分离类型及基本原理 2 液-液分配色谱 ① 正相色谱法 采用极性固定相(如聚乙二醇、氨基与腈基键合相)；流动相为相对非极性的疏水性溶剂(烷烃类如正己烷、环己烷)，常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。常用于分离中等极性和极性较强的化合物(如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等)，极性小的组分先洗出 ② 反相色谱法 一般用非极性固定相(如C18、C8)。流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。适用于分离非极性和极性较弱的化合物，极性大的组