湖南省农业技术规程-湖南省农产品质量安全协会.doc

湖南省农业技术规程 HNZ087-2015 柑橘(类似)病毒病分子检测技术规程 Technical regulations for molecular detection of citrus virus and viroid 湖南省农业委员会制定 发布日期：2015年10月29日 柑橘(类似)病毒病分子检测技术规程 为了规范柑橘（类似）病毒病分子检测操作技术，制定本规程。 1 实验室条件 具备柑橘（类似）病毒病分子生物学检测所需的实验场所、仪器和实验管理条件。 2 技术人员资质要求 从事分子生物学检测的人员应具备仪器操作和分子技术操作的能力，能力应根据相应的专业教育、培训、经验和（或）可证明的技能进行资格确认。 3 检测对象 为我国发生的柑橘（类似）病毒病害，包括柑橘衰退病、柑橘碎叶病、柑橘黄龙病、柑橘裂皮病、温州蜜柑萎缩病。每种病毒病单独检测。 4 检测样品要求 采集树体四个方向上当年抽生的枝条。对于枝条少的树体，至少采集3片带有叶柄的完全展开叶片。样品运输过程中，需要进行保湿处理（如用打湿的吸水纸包裹枝条或叶片的切口处）。样品到达实验室后，经保湿处理后贮藏在4℃低温环境，并按照附件1登记样品信息。样品在采集后三天内完成后续的样品制备工作。 5 样品制备 去除叶片，枝条用75%酒精棉擦拭，再用吸水纸吸干。枝条清洗干净后，将剥取的韧皮部切成1cm小段。对于叶片样品，去除叶柄，同样经酒精擦拭、吸水纸吸干后，再切成小块。混合同一树体的枝条（或者叶片）样品，取混合样直接进行核酸提取，或者装入自封袋内，立即放于液氮中冷冻，保存于-80℃冰箱。 6 核酸提取 对于柑橘衰退病、柑橘碎叶病、柑橘裂皮病和温州蜜柑萎缩病的检测，提取组织的总RNA；对于柑橘黄龙病的检测，提取组织的总DNA。具体操作分别参考附件2和3。每份样品的核酸物质分装一部分，放置于-80 ℃冰箱中，以备复检。 7 反转录（Reverse Transcription） 用提取的RNA进行反转录，合成cDNA。反转录的反应体系如下： dNTPs（1 mmol/L）5 μL， 5 × buffer 5 μL， RNasin（30U/μL）0.5 μL， 下游引物（10 μmol/μL）0.5 μL（引物序列见附件4）， M-MLV反转录酶（200 U/μL）0.5 μL，RNA 50 ng~5μg，最后加 DEPC 处理过的水至 25 μL。反应液在42 ℃处理1 h后，再进行95 ℃处理10min终止反应。反应在PCR 仪上进行。 8 聚合酶链式反应（PCR） 以反转录合成的cDNA 或DNA为模板，用相应的引物（引物见附件4）对其进行 PCR扩增。反应体系为： 10 × PCR Buffer 2 μL， dNTPs (1 mmol/L) 5 μL， 上游引物 (10 μmol/μL) 0.5 μL， 下游引物(10 μmol/μL) 0.5 μL， 核酸模板0.1~1 μg， Taq DNA聚合酶(2 U/μL) 0.15 μL，最后加灭菌去离子水至 20 μL。反应步骤为：94℃预变性5 min，之后94℃变性30 sec，退火（退火温度见附件4）15sec，72℃延伸60 sec，35个循环，最后72℃延伸10 min。反应在PCR 仪上进行。 9 凝胶电泳 PCR反应完成后，取扩增产物，将PCR扩增产物与2 μL上样缓冲液（10×）混合，加入到1.0%琼脂糖凝胶（含有0.5μg/ml溴化乙淀）的点样孔内，同时设置标准分子量DNA作为片段大小标准，在1×TAE 的缓冲液中进行凝胶电泳，电泳电压120 V，电泳时间约30 min。将电泳后的琼脂糖凝胶放置于凝胶成像系统内，打开紫外灯，在凝胶成像系统控制软件上观察PCR扩增条带。 10 检测对照 在样品检测的PCR和凝胶电泳操作过程中，同时设置阳性对照和空白对照。阳性对照的PCR模板为从经过分子生物学检测和生物学检测确诊的病原样品中提取的核酸物质。空白对照的PCR模板为PCR反应所用的灭菌去离子水。 11 结果判定 根据凝胶电泳的结果进行判定：检测样品和阳性对照均出现目的片段大小的扩增条带（见附件4），空白对照无目的片段扩增条带，该检测样品判为阳性，即该检测样品携带病原；阳性对照出现目的片段大小的扩增条带，检测样品和空白对照中均无目的片段扩增条带，该检测样品判为阴性，即该检测样品未检出病原。 12 检测材料废弃处理 经检测后的植物材料废弃物应进行高温消毒后再做垃圾处理。 13 技术术语 13.1 分子生物学检测 以DNA或RNA为诊断材料，通过PCR或RT-PCR技术分析基因的存在从而为病害诊断提供更直接、更科学的信息。 13.2 生物学鉴定 利用受（类似）病毒侵染能产生专化症状的指示植物进行（类似）病毒