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第四章 蛋白质相互作用研究 方法 蛋白质互作（PPI）研究方法 • 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation） • 酵母双杂交（Yeast Two-hybrid System） • 双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation，BiFC) • 噬菌体展示技术 • Pull-down • Far-western • ChIP • 荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer , FRET) 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation） • 以抗体和抗原之间的特异结合为基础，研 究蛋白质相互作用； • 当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细 胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作 用被保留了下来。如果用蛋白质X 的抗体来 免疫沉淀X ，那么与X在细胞内结合的蛋白 质Y也能沉淀下来。 免疫共沉淀示意图 免疫共沉淀的特点 • 是目前公认的蛋白质在体内互作最强有力 的证据 • 可能检测不到低亲和力、瞬间的以及低丰 度的蛋白质-蛋白质相互作用 • 常使用目的蛋白的转基因过表达植株（或 者细胞株系）来作为研究材料 免疫共沉淀的关键因素 • 抗体：抗体所针对的作用表位必须处于目 的蛋白表面 • 缓冲液：注意去污剂的成分和浓度，既要 有效释放目的蛋白复合物进入可溶相，又 不能破坏目的蛋白复合物中各成分之间的 相互作用 Yeast Two-hybrid System ） • Fields和Song 1989年创立 • 用于快速筛选与已知蛋白相互作用的蛋白 质 • 验证已知蛋白质的互作和作用强度 原理： • 酵母的转录激活因子GAL4，在N端有一个由 147个氨基酸组成的DNA结合域(DNA binding domain，BD)，C端有一个由113个氨基酸组成 的转录激活域(transcription activation domain， AD) 。GAL4分子的DNA结合域可以和上游激活 序列(upstream activating sequence，UAS)结合， 而转录激活域则能激活UAS下游的基因进行转 录。但是，单独的DNA结合域和单独的转录激 活域都不能起作用，两者只有当结合在一起或 者空间上比较接近时，才能具有完整的转录激 活因子的功能。 Y2H principles • Fuse the two proteins of interest X and Y to DBD and AD of Gal4, respectively • Interaction between X and Y reconstitutes a functional transcription factor that could then drive reporter gene expression 局限性 • 研究的蛋白质最好为非疏水蛋白 • 能在核内表达 与酵母双杂交技术相关的筛选技术 • 反酵母双杂交技术：报告基因是一些毒性标 记基因例如URA3(负选择)，只有在蛋白间相互 作用被阻断时能够显示出选择性的生长优势 • 酵母单杂交技术：通过对报告基因的表型检测， 分析DNA、蛋白之间的相互作用，以研究真核 细胞内的基因表达调控 • 酵母三杂交技术：BD 与AD 的相互靠近由组分 Z 桥联X 和Y 来完成，组分Z可为蛋白、RNA或 小分子化合物，将应用范围扩展到蛋白质- 蛋 白质、蛋白质-RNA 、蛋白质- 小分子化合物等 更广阔的研究领域。 双分子荧光互补(bimolecu