猪和山羊多能性干细胞培养体系的研究.pdf

2014 届攻读博士学位研究生学位（毕业）论文 猪和山羊多能性干细胞培养体系的研究 学科专业： 细胞生物学 研究方向： 动物细胞工程 DissertationforDoctorDegree NorthwestA＆FUniversityin2014 THESTUDYOFTHECULTURESYSTEMFOR PLURIPOTENTSTEMCELLSFROMPIGANDGOAT Major:CellBiology Research field:AnimalCellEngineering 猪和山羊多能性干细胞培养体系的研究 摘 要 多能性干细胞是一类具有自我更新能力和能够实现向内、中、外三个胚层分化的细 胞。多能性干细胞在家畜如猪、牛、羊等动物中有广泛的应用价值，例如用于研究器官 移植、人疾病模型以及生物药品的研制开发等，是具有重要研究意义的细胞材料。近年 来，许多研究都尝试获得家畜多能性干细胞，然而这个过程中依然存在着很多困难和问 题。如：获得的多能性干细胞不能在体外长时间稳定传代、多能性基因表达特征不统一、 不能获得嵌合体动物或嵌合率低等。到目前为止依然没有公认的可供参考的家畜多能性 干细胞系，没有适合多能性干细胞的培养体系可能是最主要的问题之一。本研究主要对 猪和山羊的多能性细胞进行了研究。关于猪的多能性细胞研究，我们首先以猪胚胎生殖 细胞（EGCs）为参考，通过添加各种细胞因子和化学小分子来优化培养条件，初步确 定了适合猪多能性干细胞的培养体系。并在此基础上，诱导获得了猪诱导多能性干细胞 （iPSCs）。在对获得的猪iPSCs 进行鉴定确定其多能性之后，我们探讨了培养条件中 SB431542 BMP4 piPSCs mRNA 和 在诱导 形成过程中的作用机制。此外，我们通过 和 miRNA测序对piPSCs的转录组特性进行了分析。关于山羊的多能性细胞的研究，我们 尝试用不同的培养条件分离山羊ES 样细胞，并在此培养条件基础上进行了山羊iPSCs 诱导。同时在此过程中构建了用于监控细胞多能性的报告系统。具体结果如下： 1. EGCs 1. EGCs 11.. 猪胚胎生殖细胞（EEGGCCss）的分离培养 通过改变饲养层细胞的类型以及在培养基中添加各种小分子化合物来筛选适合猪 EGCs的培养条件。在基础培养基（DMEM +15%FBS+10 ng/mLhLIF +10ng/mLFGF2 +40ng/mLhSCF PD0325901 CHIR99021 SB431542 ，详见 ）中添加 、 和 三种小分 子化合物（详见），通过统计碱性磷酸酶（AP）染色阳性的EGCs 克隆数目来确 定最适的培养条件。之后，在此培养条件的基础上，比较了MEF、PEF及中肾区基质细 胞饲养层对猪EGCs的影响，确定了MEF饲养层为最适合的饲养层。 2. piPSCs 2. piPSCs 22.. 猪诱导多能性干细胞（ppiiPPSSCCss）的建系及不同培养条件对细胞重编程的影响 利用人的四因子OSKM（OCT4、SOX2、KLF4及C-MYC）对猪胎儿成纤维细胞（PEF） 进行诱导，并且在猪EGCs培养条件的基础上对猪iPSCs的培养条件进行优化，确定了 最适合的培养条件，在此条件下获得了两株能在体外稳定传代的piPSCs系，将其命名 为LFB2i-piPSC1和LFB2i-piPSC2。 获得的两株piPSCs和人的胚胎干细胞（hESCs）类似，具有高的核质比并且表现出 AP阳性。对这两株piPSCs进行分子及细胞生物学鉴定，结果表明该细胞具有外源基因