有参考基因组_转录组ref流程工作手册.pdfVIP

转录组ref 流程工作手册 一、Reference 流程生物学原理 1.1 实验流程 Total RNATotal RNA eukaryoteeukaryote prokaryoteprokaryote Enriched mRNA by OligoTEnriched mRNA by OligoT Remove rRNARemove rRNA RNA fragmentRNA fragment (200~700 bp)(200~700 bp) Random hexamerRandom hexamer primed cDNA synthesisprimed cDNA synthesis Size selection,Size selection, then PCR amplificationthen PCR amplification Solexa SequencingSolexa Sequencing 图一：转录组实验流程 当我们得到样品时，必须对其测序，才能得到分析所需的数据。测序基本过 程：提取样品总RNA 后，用带有Oligo(dT) 的磁珠富集真核生物mRNA （若为原 核生物，则用试剂盒去除 rRNA 后进入下一步）。加入 fragmentation buffer 将 mRNA 打断成短片段，以mRNA 为模板，用六碱基随机引物（random hexamers ） 合成第一条cDNA 链，然后加入缓冲液、dNTPs、RNase H 和DNA polymerase I 合成第二条cDNA 链，在经过QiaQuick PCR 试剂盒纯化并加EB 缓冲液洗脱之 后做末端修复并连接测序接头，然后用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，最后 进行PCR 扩增，使用建好的测序文库进行测序。 得到RNA 的序列后，又可以找到它的参考序列（物种本身的基因、基因组） 时，可以用reference 流程对数据进行详细的分析。Reference 后面所有的流程都 是基于参考序列进行的，所以选择正确的参考序列十分重要。 1.2 信息分析流程 得到测序序列后，即可利用比对软件，将所测序列比对到参考基因或基因组 上，并进行后续分析，信息分析流程图如下： 图二：转录组信息流程 1.2.1 原始fq 序列简介 测序得到的原始图像数据经base calling 转化为序列数据，我们称之为 raw data 或raw reads ，结果以fastq 文件格式存储，fastq 文件为用户得到的最原始文 件，里面存储reads 的序列以及reads 的测序质量。在fastq 格式文件中每个read 由四行描述： @read ID TGGCGGAGGGATTTGAACCC + bbbbbbbbabbbbbbbbbbb 每个序列共有4 行，第1 行和第3 行是序列名称(有的fq 文