向日葵染色体核型及其遗传转化的研究_第二部分研究内容_50_140.pdf

第二部分 研究内容 第一章 向日葵根尖细胞有丝分裂及核型分析 向日葵隶属于菊科向日葵属，具有耐盐碱、耐干旱、耐瘠薄、适应性强的特 点。人工栽植向日葵距今约有 500 多年历史，向日葵真正进入大田栽培是在 19 世纪中叶，从此它成为人类栽培的主要油料作物之一。20 世纪 60 年代以来，向 日葵在世界各地得到迅速发展，其油脂产量仅次于大豆。目前，世界上已有 40 多个国家种植和食用。 核型（Karyotype ） 一般是指体细胞染色体在光学显微镜下所有可测定的表 型特征的总称。核型分析（Karyotype annlysis ） 就是对核型的各种特征进行定量 和定性的表述。研究和比较各物种的核型可以确定物种染色体的整体特征，有助 于对物种间科、属、种的亲缘关系进行判断和分析，揭示遗传进化的过程和机制。 核型分析也是细胞遗传学、染色体工程、基因定位、细胞分类学以及现代进化理 论等学科的基本研究方法（李贵全, 2001 ）。本研究报道了向日葵有丝分裂全过 程，同时，对 8 个基因型向日葵进行了核型分析，以期为与之有关的向日葵的细 胞学分类、选择杂交的亲本组合、培育新品种及转基因向日葵的细胞学检测等方 面提供细胞学依据。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 植物材料 供试向日葵材料为 F53 、2603 、2736 、89B1、HA300 、B7 、RHA266 和 PR29 ， 其中，F51 为从市场购买的油葵，其余自交系或品系均由天津大学农业与生物工 程学院植物基因工程研究中心提供。 1.1.2 试剂 秋水仙素、对二氯苯和 8 -羟基喹啉为分析纯，分别用蒸馏水配制成 0.05 %、 41 饱和及 0.002 mol/L 各浓度水平，改良苯酚品红等染液，卡诺氏固定液，冰乙酸， 甲醇，无水乙醇，95 ％乙醇，1mol/L 盐酸，1％果胶酶与纤维素酶混合液等。 1.1.3 主要仪器与用具 荧光显微镜、恒温箱、水浴锅、计时器、培养皿、酒精灯、小烧杯、试管、载 玻片、盖玻片、镊子、剪刀、刀片、解剖针、吸水纸、纱布、等常用工具。 1.2 方法 1.2.1 材料预处理 选取饱满的向日葵种子，用水浸泡 12h，使其充分吸水；然后在28 ℃恒温条件 下培养。当胚根长至 1.0～1.5 cm 时，把它们分别用以下方法处理：新配制的 0.05 % 的秋水仙素水溶液、对二氯苯饱和水溶液和0.002mol/ L 的 8-羟基喹啉水溶液各处 理 3h ；用蒸馏水于4 ℃低温冷冻箱中处理20 h ；对照继续在28 ℃恒温条件下培养 3h 。然后切取处理过的根尖。用新配制的卡诺固定液处理 24h ，换入 70 % 的酒精中， 于 4 ℃冰箱中保存。 1.2.2 解离 从70 ％乙醇中取出固定好的向日葵根尖→流水冲洗３min→吸水纸吸干→放入 小试管中→加适量 1 mol/L HCl 于 60±0.5℃水浴解离 10～15min，有时酸解后还可 在 37℃下酶解20min 。 1.2.3 染色和压片 针对不同材料或希望获得不同的效果，可选择适当的染液和染色方法。用于常 规染色体形态结构鉴定的染色方法很多，我们采用改良苯酚品红染色：若只作临时 镜检观察，对解离后材料水洗并吸干，挑取根尖乳白色分生组织于载玻片上切成尽 量薄的切片，滴加 1 滴染液染色 2～3min 。盖上盖玻片，覆一层吸水纸，用解剖针 垂直敲打，或以拇指垂直紧压盖片（注意勿使盖片搓动），使材料分散压平，便于 观察。 1.2.4 镜检和观察统计 42 通常染色清晰而又分散得很好的分裂相只是少数，因此压片后要认真仔细地进 行镜检。先在低倍镜下寻找有分裂相的视野，再用高倍镜或油镜仔细观察、记数或 拍照。调节可变光栏与反光镜，使光线明暗合适，视场亮度适中。注意观察有丝分 裂全过程的染色体形态变化，找出染色体分散好的中期细胞进行染色体计数，对好 的分裂图像作上标记，以便再观察。每一处理观察 3～5 个根尖制片，记录每个视 野中分裂的细胞数及分别处于前、中、后末期的细胞数，统计有丝分裂各分裂相的 比率和中期细胞中染色体数目。 1.2.5 显微照相和测量 将在显微镜下选定的符合要求的细胞进行显微照相（可用10×100倍的油