人体胚胎干细胞.pdfVIP

第五课 人胚胎与胚胎干细胞的培养 引言  自1998年Thomson实验室建立首株人ES细胞系以来,全世 界范围内已经相继建立1200多株不同的人ES细胞系。然而, 研究者们仍致力于建立新的人胚胎干细胞系,尤其是HLA配型 及各种族人群的。  很多声称衍生出的人ES细胞并没有严格的特征描述和评估 。列于NIH干细胞注册协会中的只有21株有证实的特征描述 ，可以用于广泛的学术交流。 内容提要  人胚胎培养  人胚胎干细胞的衍化生成与维持培养  人胚胎干细胞的特征描述 hESC建系使用的胚胎来源  体外受精IVF或单精注射等辅助生殖技术中的剩余胚胎,经患 者知情同意后，可以用于科研，建立hESCs  患者已成功妊娠或由于其它原因而放弃的新鲜或冻存胚胎。  一些评分较低，不适于移植的胚胎。  经验表明，高质量的胚胎衍化效率更高，因此最佳的人胚胎 培养体系就成为所有衍化实验室工作效率的关键。 受精卵制备  取卵后三四小时，将精子和卵子放在一起进行体 外受精或进行单精子卵细胞浆内注射。  从培养箱中取出卵子预培养皿和已调整好精子密 4 度的精子制备液，按照(3-5) ×10 个精子/每个卵 子的比例加入精子，将受精培养皿放回体积分数 5.0%CO2、37 ℃培养箱中继续培养4-9 h 。 胚胎体外培养常用方法  悬滴培养法(盖玻片或凹载片)  旋转管培养法(管状培养器皿)  灌注小室培养法(两个盖玻片或金属圈)  培养瓶培养法  培养板培养法 培养板培养法  四孔培养板：在每孔加入500 μL受精液和100-150 枚体外成熟的卵母细胞，然后加入获能处理的精子 9 -1 (1.0-1.5)×10 L ，在培养箱中孵育6-24 h 。  微滴培养板：在塑料培养皿中用受精液做成20-40 μL的微滴，上覆蜡油，然后每滴放入体外成熟的卵 9 -1 母细胞10-20枚及获能处理的精子(1.0-1.5)×10 L ，在培养箱中孵育6-24 h 。 胚胎质量评价标准  Ⅰ级胚胎：胚胎卵裂球均匀规则,胞质均匀透明,透明带完整, 胚胎无或仅有极少(10%)的碎片。  Ⅱ级胚胎：卵裂球形态轻度不均匀规则,胞质折光性有轻微 变化,碎片30%，透明带完整。  Ⅲ级胚胎：胚胎内碎片50%,其余卵裂球形态同II级,透明带 完整。  Ⅳ级胚胎：胚胎内碎片50%,碎片外卵裂球具有活细胞特征 。胞浆折光性有较大改变，胞浆变黑、颗粒不均匀。 胚胎活组织检查  选用受精第3天，有核卵裂球＞5，破碎率＜25%的 胚胎进行卵裂球活组织检查。  活组织检查时，将胚胎放于无钙镁离子的培养基液 滴内，激光打孔，斜面微管（直径30-35um ）获取 卵裂球。 人受精卵到囊胚的发育过程（0-5d ） A 两细胞胚胎 B 8细胞胚胎 C 紧束化囊胚 D 扩张的囊胚 人囊胚的各种形态 早期囊胚