全的蛋白质_酶纯化,动力学参数及电泳问题详解.pdf

麻省理工大学生物学教研室  7.02  实验性生物学  交流, 2005 年 春                                            7.02/10.702                                                               2005 春            7.02/10.702  蛋白质生化(PBC) 问题  2005 春  参考答案      7.02/10.702                                                               2005 春  问题1   你有一个蛋白裂解粗产物的样品，是含有6 种蛋白(1, 2, 3, 4, 5,和β‐半乳糖苷酶)的混合 物，而你的目标是获得纯化的β‐半乳糖苷酶。下表所列的是这些蛋白的一些性质：  蛋白  沉淀所需的硫酸铵(AS)的浓度  分子量  (kDa)  等电点  (pI)  1  45%  38  3.7  2  80%  22  4.8  3  65%  4  5.3  4  20%  75  6.8  5  30%  55  9.50  β‐半乳糖苷酶  45%  115  5.3    你通过硫酸铵沉淀来开始你的纯化过程。你向粗提产物样品中加入适当浓度的硫酸铵， 4 ℃过夜孵育，然后离心得到上清(AS‐S)和沉淀(AS‐P)。    a)  你将使用浓度为多少的硫酸铵来沉淀β‐半乳糖苷酶？   45%     b)  在加入该浓度的硫酸铵并离心之后，上清(AS‐S) 中有哪些蛋白？ _____2,3________  c)  沉淀(AS‐P)中又有哪些蛋白?     1,4,5,β‐半乳糖苷酶      d)  在将沉淀用过柱缓冲液重悬后，你会用PD‐10 柱来   脱盐    你的样品。    将AS‐P 样品中的β‐半乳糖苷酶从其他杂蛋白中提纯出来的一个方法是根据它们的分子 量大小（不同）使蛋白质得以分离。    e)  那种类型的柱子是根据这个原理分离蛋白的？    凝胶过滤 (分子筛    )  f)  从这类柱子中被首先洗脱出来的是那种蛋白（来自你的AS‐P）?  β‐半乳糖     另一方面，你决定使用离子交换层析法从你AS‐P样品的其他蛋白中进一步纯化β‐半乳糖 苷酶。你首先使用pH为5.0的过柱缓冲液来平衡阴离子交换柱。  g)   阴离子交换柱基质带有何种电荷？   正电荷      h)   当pH为5.0 时，AS‐P中的哪些蛋白将被吸附到柱上？    1