基因工程药物现代仪器分析法.docVIP

基因工程药物的现代仪器分析法 随着分子生物学的发展，出现了许多基于重组DNA技术的特效药物，如治疗肾性贫血的基因工程人红细胞生成素(rHuEPO)，治疗白细胞缺乏的基因工程人粒细胞集落刺激因子(rHuG-CSF)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rHuGM-CSF)，这些药物与传统的化学合成药物不同，其结构复杂，生产难度大，很难或无法采用分析小分子化学药物的手段表征其纯度、含量和结构。美国FDA在审批这些药品时，严格控制其生产过程和生产地点。如果能建立一套仪器分析方法，像表征小分子合成药物那样简便，则可使基因工程药物的开发时间缩短，生产成本降低。目前国内外的生物技术工作者，将大量的精力都集中在基因工程产品的上游研究，而对质量控制的研究相对较少。如何用仪器分析方法与动物体内生物学活性测定法相结合，有效地控制基因工程产品的质量，是目前国内外分析界和生物技术界研究的热点之一。 1　基因工程药物的特点基因工程药物是通过对核酸分子的插入、拼接和重组而实现遗传物质的重新组合，再借助病毒、细菌、质粒或其他载体，将目的基因转移到新的宿主细胞系统，并使目的基因在新的宿主细胞系统内进行复制和表达的技术。最先应用基因工程技术的产业领域就是制药工业。基因工程技术在制药工业中的应用主要有重组蛋白质类药物、疫苗及单克隆抗体等的生产。与化学合成法、组织提取法或传统的发酵法相比，生产成本低。目前以DNA重组技术为基础的生物技术成果主要集中在蛋白质类、多肽类基因工程药物和基因工程疫苗。多肽和蛋白质通常是由20种α-氨基酸通过肽键联成的长链分子，有些还含有非肽链结构的其他组成成分，如糖蛋白等。蛋白质分子很大，组成其氨基酸的数目常在100个以上，有些甚至达上千个，其结构十分复杂。蛋白质的分子结构有不同的层次，通常有一级结构、二级结构、三级结构和四级结构。蛋白质的高级结构是由其一级结构所决定，所以一级结构是蛋白质分子结构的基础，正确表征显得尤其重要。表征蛋白质一级结构的内容有含量、纯度、等电点、分子量、肽谱、氨基酸序列和N-端序列等。高级结构的质量控制难度较大，仍在探索研究中，目前主要是通过其一级结构的质控来实现。与一般药品相比，除具有复杂的分子结构外，基因工程药物还有一大特点就是它来源于活的生物体(细菌或细胞)，它的生产涉及到生物材料和生物学过程，如发酵、细胞培养、分离纯化目的产物等，这些过程有其固有的易变性，因此必须对原材料、培养过程、纯化工艺过程、最终产品进行全面的质量控制。由于基因工程药物分子的这些特殊性，目前经常采用的方法主要有生物学技术和传统的生化分析技术，如细胞株依赖法、凝胶电泳法和紫外光谱法等。用于基因工程产品质量研究的现代仪器分析法主要有质谱(MS)、高效毛细管电泳(HPCE)、高效液相色谱(HPLC)、CE-MS和LC-MS联用技术等，其中MS法有电喷雾质谱和基体辅助激光解吸飞行时间质谱法。在基因工程产品研究和生产中，用仪器法可以解决以下几个重要问题：(1)产物在表达和纯化后的纯度如何?(2)表达产物的一级结构是否正确?(3)蛋白质是否经过后修饰?(4)不同表达载体、不同批次的产品质量稳定性如何?(5)生产条件的更改及优化对最终产品质量的影响如何?(6)制剂中微量活性成分的质量如何?(7)糖蛋白的微观不均一性如何?(8)如何判断假劣药品等。 2　毛细管电泳法在基因工程药物质量研究中的应用 2.1　毛细管电泳法及其特点电泳分离是依据电场中溶质的不同迁移速率，毛细管电泳(CE)是在毛细管中进行的电泳分离。 CE是电泳的分离机理与色谱的仪器自动化相结合的产物，尤其适用于离子型物质的分析。蛋白质类生物大分子在等电点以外的环境中均带有净电荷，不同的蛋白质其分子大小、荷电情况不同，由CE分离得到的图谱可反映蛋白质的分子结构信息；传统表征蛋白质的许多方法都是基于凝胶电泳，如SDS、IEF等，与CE具有很大的相似性，故有丰富的经验可供借鉴；另外，CE所需样品量少，选择性好，易与其它高灵敏度的检验器相结合。 CE的应用范围很广，其中应用最多的首推肽和蛋白质，这也是CE发展的初衷。 2.2　在鉴别研究中的应用 CE在蛋白质和肽鉴别分析中应用最多的是CZE测定肽谱、SDS-CGE测定蛋白质分子量及CIEF测定蛋白质的等电点等。肽谱是鉴别蛋白质一级结构的指纹图谱，利用CE的高分辨率，可以分离得到更为特征的肽谱。常用的消化试剂有胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、溴化氰、Arg-C和Glu-C等。常用的检测手段有紫外吸收法、激光诱导荧光法及质谱法等。Frenz等［1］通过对重组人生长激素(rHuGH)的HPLC和CE肽谱比较后，认为两者可互作补充，并且CE可提供更多的蛋白质一级结构的信息，测定快速。Apffel等［2］采用HPLC和CE测定了单链纤溶酶原激活因子(DSPAαl)的Arg