实验二重组质粒酶切鉴定2016.pdf

实验二 重组DNA的提取 及酶切鉴定 1 实验目的 掌握以下方法和技术： 1. 质粒DNA的小量快速制备 2. 质粒DNA的限制性内切酶酶切 3. DNA的琼脂糖凝胶电泳 2 实验原理 1. 质粒DNA的小量快速制备 分离质粒DNA有三个步骤： 1. 培养细菌使质粒扩增 2. 收集和裂解细菌（本实验：SDS裂解） 3. 分离和纯化质粒DNA （本实验：碱变性法） 碱变性法抽提质粒DNA Solution II Solution III 离心后去向 pH12.6 pH4.8 染色体 氢键断裂， 不能复性 沉淀中 DNA 双螺旋解开 氢键部分断 裂，cccDNA 质粒DNA 复性 上清中 互补链不完 全分离 硅基质材料(树脂）与DNA双链相互作用的原理 DNA分子中的磷酸二酯键骨架在盐溶液 的作用下脱水，使得暴露的磷酸基团吸附硅 胶。双链DNA分子一旦被硅胶吸附，一般的 洗液不能将其洗脱下来，只有水溶性的缓冲 液，如TE或水重新水化后，DNA才能从层 析柱上定量回收。 2. 质粒DNA的限制性内切酶酶切 c-myc基因片段4.8 kb BamH I + Xba I双酶切（酶切完 全时） pSV-c-myc 琼脂糖凝胶电泳凝胶中2条区带 3.5kb pSV2载体片段 BamH I Xba I 4.8kb c-myc 目的基因片段 pSV2载体片段3.5kb 3. 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖-海藻中提 不同类型琼脂糖的特性 取的线状高聚物 琼脂糖类型 凝结温度/ ℃ 熔化温度/ ℃ 加热融化成清澈、 透明的溶液 标准琼脂糖 35~38 90~95 低熔点琼脂糖 25~35 63~65 凝固后成凝胶 DNA在凝胶中的迁移率的影响因素  DNA分子的大小  琼脂糖的浓度  DNA 的构象  所加电压  嵌入染料的存在  电泳缓冲液的组成及其 离子强度 DNA条带迁移距离（cm) （一般采用相对迁移率会更好） 不同含量标准的琼脂糖凝胶的分离范围 琼脂糖凝胶浓度 DNA分子分离范围