WB问题答疑.pdf

Western Blot实验工具及优化介绍 ——默克密理博新产品及经验分享 邓中帆(Stefan Deng) 为什么做Western Blot? 目的蛋白是否在相应的组织/细 胞中表达？ 目的蛋白在目标组织/细胞中表 达的量和位置上的变化：病理/ 生理，药物处理，发育阶段 目的蛋白与其它蛋白的相互作 用 重组蛋白表达与否？表达完整 性？ Western Blotting基本过程 样品制备 电泳 印迹 免疫检测 足量、完整的蛋白样品， 将复杂的蛋白样本中的各种 将胶里的蛋白转移到膜 显示目的蛋白是否 蛋白组分有效分离开 上，并有效结合在膜上 存在或量的变化 尽量减少杂质干扰， 浓度适宜  合适的组织/细胞裂  浓缩胶与分离胶  湿转或半干转  封闭剂 解、抽提试剂和方法  上样缓冲液  转移缓冲液  漂洗缓冲液 ，特殊的分级富集及 去除高丰度蛋白操作  蛋白样品/marker  PVDF膜或NC膜  一抗  特异性亲和纯化  相关设备  滤纸  二抗 （琼脂糖珠或磁珠）  染色检查  检测显示方法  生色  浓缩/缓冲液置换  化学发光  荧光 WB成功的核心要素 有足够的目的蛋白结 抗体与抗原的有效 合到膜上 + 结合 优质的蛋白样本，足够的目的蛋 膜上的蛋白必须可以被抗体检 白从胶转移到膜上并一直保持有 测，采用正确的抗体，抗体必 效结合 须具备较高的特异性亲和力 高效检测 最后为了获得可见的数据，必须保证检测系统的有效性 蛋白样品制备 样品制备 电泳 转膜 封闭 抗体检测 显色 起始样本的准备 st 纯化蛋白 nd 浓缩及缓冲液置换 rd 你的蛋白从哪里来？ 1 2 3 细胞培养上清 免疫共沉淀获得的样品