第三部分病毒学实验方法..PDFVIP

第三部分 病毒学实验方法 病毒是微生物中体积最小的一种，绝大部分在普通光学显微镜下不能看到，需用电子显 微镜才可查见。由于病毒具有严格的寄生性，必须在易感的活组织(细胞)中才能增殖，故通 常将其接种于动物(小鼠、家兔及猴等)、鸡胚胎或组织(细胞)中使之增殖，但并非所有标本 均需依次接种于动物、鸡胚胎或组织培养中进行病毒的分离鉴定，而是根据具体情况而定。 有些病毒在寄生的细胞内增殖后可导致细胞病变，或可在受感染的细胞内形成形态学上特异 的斑块，称为包涵体，此可用普通光学显微镜检视。 病毒性疾病常用的血清学检查法为血凝抑制试验、补体结合试验及中和试验。近年来， 随着科学技术的进展，在原有血清学检查技术的基础上，又建立了具有特异性强且敏感性又 较高的新的血清学检测法，如荧光抗体检测技术，酶联免疫检测技术—EILSA 及固相放射免 疫技术等，在实际工作中，可随检查目的的不同而选不同的方法。 实验十五 病毒感染后的形态学观察 一、电子显微镜技术 病毒体积微小，不仅肉眼看不见，即使是分辨率最好的光学显微镜也只能看到个别的大 病毒。20 世纪 30 年代初电子显微镜的发明，扩大了人们的视野。在电子显微镜下，不仅能 观察到各种病毒的外观，且可看清其结构。为了观察病毒与细胞的关系。一般将接种病毒的 组织（细胞）培养固定，包埋后进行超薄切片，染色后进行观察；为观察病毒形态与结构， 可用磷钨酸负染法。 (一)磷钨酸负染法 磷钨酸负染法是利用重金属盐类溶液处理生物标本，使它在电镜下呈现出良好的反差。 经此种染色处理的生物标本。在电镜下与正染色相反，观察到的不是亮环境下的黑色物象而 是暗背景(重金属染液)下的亮象(物体)。 【材料】 (一)病毒悬液。 (二)染液：磷钨酸盐(钠、钾) (三)铜网 【方法】 (一)用吸管吸取少量病毒悬液，直接滴在铜网上，一般每份标本 3-4个铜网。待 3-5 min 后吸去悬液或用小片滤纸吸干。然后用另一吸管吸染液滴于铜网上，待 2-3 min 吸去多余染 液，待自然干燥后即可进行电镜观察。 61 (二)电镜观察： 1 ．形态：电镜下病毒有球形，杆形和蝌蚪形等。粘病毒呈杆状或多形态，腺病毒和小 RNA 病毒属球形，噬菌体呈蝌蚪形。应用电镜技术也可准确的测量病毒体的大小。一般无 胞膜病毒大小比较一致；有胞膜病毒则变动较大，对这类病毒的大小测定，应求其平均值。 病毒大小使用的单位为毫微米即纳米(nm)，可按公式计算： 病毒体直径(nm) 6 病毒体大小(nm)= ×10 放大倍数 2 ．结构：一般而言，大部分球形病毒属立方体对称，大部分杆形病毒属螺旋对称。如 腺病毒和小 RNA 病毒呈 20 面对称；流感病毒则呈螺旋对称。电镜还可观察病毒有无胞膜 及亚单位结构。 (二)病毒感染组织的超薄切片（略） 二、病毒包涵体的观察 在某些病毒感染的细胞内，经染色后，常可在其细胞浆或核内的局部见到一些嗜酸性或 嗜碱性的染色改变，称为包涵体。病毒感染形成的包涵体，因在组织细胞内定位不同及其本 身的嗜染色性不同而具有诊断价值(如狂犬病病毒包涵体位于脑神经细胞浆内，腺病毒包涵 体位于感染的细胞核内，而巨细胞病毒包涵体则可在胞浆和核内发现)。 【材料】 (一)巨细胞病毒 (二)传代人胚肺纤维母细胞培养小瓶 (三)苏木精一伊红染色液 (四)Borin 固定液 【方法】 (一)将巨细胞病毒接种于有盖玻片的传代人胚肺纤维母细胞培养小瓶中，37 ℃孵育， 待其出现 80-100％细胞病变后，取出盖玻片,在生理盐水中漂洗 2 次。 (二)用Borin 固定液将上述漂洗后的盖玻片固定 20-30min。再用生理盐水冲洗 2次。 (三)苏