定量PCR实验操作流程.ppt

定量PCR实验操作流程 一：实验目的 本实验室定量PCR实验都为检测基因在mRNA水平的表达量 这次示例以检测mRNA水平的表达量为例，通过染料法(SYBR Green)进行相对定量PCR实验，分析LPS诱导巨噬细胞中IL-6表达 二：背景资料 样品为LPS处理不同时间（0，1，3，6，12，24h）的巨噬细胞提取RNA。 测试基因共两个：为IL-6（NM_031168），内参基因GAPDH（NM_008084）。 三：实验内容 细胞RNA抽提 RNA反转录 定量PCR检测 数据分析 四：实验主要仪器和试剂 主要实验仪器 冷冻超速离心机 常规PCR仪 酶标仪 电泳系统 CFX96 Real Time PCR System 四：实验主要仪器和试剂 主要实验试剂 RIzol（Invitrogen）、RNA级氯仿、冷冻异丙醇及冷冻的75%乙醇、DEPC灭菌水 TaKaRa Kits 五：实验操作 前期准备 为避免RNase 对RNA的降解及其提高实验的精确性，在实验前请准备好用DEPC处理过的离心管及其移液枪头，同时实验操作时，需戴口罩及其一次性手套。所有实验操作尽可能在冰上进行。 五：实验操作 RNA抽提 样品处理 贴壁细胞，去培养基后可直接加入TRIzol(5~10×107细胞数加约为1mLTRIzol)，反复吹打裂解细胞，再收集TRIzol至离心管中； （Note：如为悬浮细胞，先离心收集，加入TRIzol(5~10×107细胞数加约为1mLTRIzol)反复吹打裂解细胞，如为新鲜组织样品，可取50mg～200mg样品直接在液氮中研磨至粉末，再转移一定量至含1mLTRIzol的离心管中，反复振荡裂解组织细胞）。 五：实验操作 RNA抽提 相分离 室温放置上述样品液10min左右后，每1mLTRIzol 中加入氯仿为200μL，盖上盖子，剧烈振荡约1min，室温静置5min，然后12000g 冷冻离心15min（4℃），小心取出样品，通过观察可以发现样品分三层，其中最上层含有RNA样品。 五：实验操作 RNA抽提 RNA沉淀 小心吸取上清液约450μL（每1mLTRIzol 的吸取量）至含有600μL冷冻异丙醇的新离心管中，混匀，12000g 冷冻离心10min（4℃）。 五：实验操作 RNA抽提 RNA洗涤 去上清，加入500μL 冷冻的75％乙醇，弹起沉淀后 12000g 冷冻离心5min（4℃），去上清，再稍离，吸去上清液。 五：实验操作 反转录反应 五：实验操作 反转录反应 普通RT-PCR反应，获得cDNA产物 -20℃保存反转录产物 五：实验操作 定量PCR实验 五：实验操作 定量PCR实验 五：实验操作 定量PCR实验 将96孔板或八联管进行短暂离心，确保所有反应液在反应孔底部。 PCR反应, 可以采用标准的三步法程序，也可以用二步法进行反应 在PCR反应后，进行熔解曲线分析 （Note：上机操作） 五：实验操作 实验数据分析结果 五：实验操作 实验数据分析结果 * 五：实验操作 RNA抽提 RNA溶解 风干约5～10min（注意不能风太干，只需要沉淀泛白即可），加入DEPC水约30μL。贴上标签后-80℃保存。 五：实验操作 RNA抽提 RNA浓度测定 吸取2μL 抽提的RNA 用DEPC水稀释100倍后，在酶标仪上测定RNA浓度，以DEPC水做空白对照，同时记录RNA浓度及其OD260/OD280。  按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。 *3 20 μl Total 7 μl dH2O *2 1 μl 模板（cDNA溶液） 0.5 μM*1 1 μl PCR Reverse Primer（10 μM） 0.5 μM*1 1 μl PCR Forward Primer（10 μM） 1× 10 μl SYBR? Premix Ex TaqTM II（2×） 终浓度 使用量 试剂 *1 通常引物终浓度为0.4 μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在0.2～1.0 μ范围内调整引物浓度。 *2 建议在25 μl反应液中使用相当于10 pg～100 ng Total RNA量的cDNA为模板。反转录反应液的加入量不能超过PCR反应液总体积的10%。 *3 建议反应液体积为20 μl。（节省试剂，最低可降至15 μl） 1 no treat 2 LPS_0.1ug/ml_1h 3 LPS_0.1ug/ml_3h 4 LPS_0.1ug/ml_6h 5 LPS_0.1ug/ml_12h LPS_0.1ug/ml_24h Negitive Control(NC) GAPDH IL-6 *