基因工程操作步骤高三生物一轮复习.ppt

考点2 基因工程的基本操作步骤 1.从基因文库中获取目的基因 基因文库：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体细胞的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。 种类：基因组文库和部分基因文库（如cDNA文库） 目的：分离有用的目的基因和保存某种生物的 全部基因。 ①基因组文库的构建 ②CDNA文库的构建： CDNA来源：提取生物某发育时期的mRNA 基因组文库和CDNA文库比较 (1)酶：解旋酶和DNA聚合酶 （2）能量：ATP （3）原料：4种脱氧核苷酸 （4）原则：碱基互补配对原则 （5）场所：主要在细胞核，线粒体和叶绿体 （6）模板：解开的DNA双链 ②引物：一小段DNA或RNA，它能与DNA母链的一段碱基序列互不配对，用于PCR的引物一般由20-30个核苷酸构成。 引物设计注意：（1）引物内部避免形成二级结构（2）引物间避免有互补序列 PCR技术与DNA复制比较 （2011.33）（8分）请回答基因工程方面的有关问题： (1)利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似（如下图所示）。图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。 ①从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占的比例为 ▲ 。 ②在第 ▲ 轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段。 (2)设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物（只标注了部分碱基序列）都不合理（如下图），请分别说明理由。 (3) PCR反应体系中含有热稳定DNA聚合酶，下面的表达式不能正确反映DNA聚合酶的功能，这是因为 ▲ 。 (4)用限制酶EcoRV、Mbol单独或联合切割同一种质粒，得到的DNA片段长度如下图(1 kb即1000个碱基对)，请在答题卡的指定位置画出质粒上EcoRV、Mbol的切割位点。 3.人工合成 基因较小，核苷酸序列又已知，可以利用DNA仪自动合成。 1）反转录法：以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。 2）根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ： 目的：使目的基因在受体细胞中能稳定的存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能表达和发挥作用。 启动子：位于基因的首段，一段有特殊结构的DNA片段，是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动转录的mRNA，最终获得所需要的蛋白质。 终止子：位于基因的尾端的一段特殊结构的DNA片段，终止转录。 标记基因：为了鉴别受体细胞是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。 3.将目的基因导入受体细胞 转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 植物--农杆菌转化法 1.特点：易感染双子叶和裸子植物。对大多数单子叶无感染力。 原理：Ti质粒的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。 基因枪法：单子叶植物 花粉管通道法：抗虫棉 动物-显微注射法 表达载体提纯—取卵（受精卵）--显微注射—转基因的受精卵------------转基因的动物 微生物--- Ca2+转化法 过程：用Ca2+处理细胞---感受态细胞---表达载体与感受态细胞混合----感受态细胞吸收DNA 早期基因工程用微生物做受体细胞原因：繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少 DNA分子杂交原理：互补的DNA单链能在一定条件下结合成双链，既能进行杂交，这种结合是特异的。即严格按照碱基互补配对进行。因此，当用探针和转基因生物DNA杂交时，如果出现杂交带（用特殊的显影装置可以看见），则说明目的基因已经插入受体细胞的染色体DNA中 基因探针：一小段单链DNA或RNA, ①带有放射性同位素标记，②能与目的基因的一条链发生碱基互补配对。 抗原与抗体杂交：检测抗虫棉是否翻译出毒蛋白：从苏云金杆菌中提取毒蛋白，注入某种动物体内，从动物的血清中分离出相应的抗体，并用荧光标记该抗体。然后用标记的抗体与抗虫棉细胞提取液混合，若出现杂交带，则表明抗虫基因已经在棉花细胞表达。 目的基因 质粒 启动子 终止子 2.基因表达载体的构建 1.用一定的_________切割 质粒，使其出现一个切 口，露出____________。 2.用_____________切断目 的基因，使其产生_____ ____________。 3.将切下的目的基因片段插入 质粒的______处，再加入适量___________，形成了一个重组DNA分子（重组质粒） 限制酶 黏性末端 同一种限制酶 的黏性末端 切口 DNA连接酶 相同 用同种限制酶分别切割目的基因和质粒，使之露出相同的粘性末端，再加入DNA连接酶. 植物细胞 动物细胞 微生物细胞 农杆菌